鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接ELISA方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及鉴别猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)血清抗体间接ELISA方法及其应用。本申请基于CSFV E2和BVDV E2蛋白截短保守区域进行原核表达纯化，获得了高纯度的CSFV

【技术实现步骤摘要】
鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接ELISA方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接ELISA方法及其应用。

技术介绍

[0002]猪瘟(classical swine fever,CSF)是一种猪的传染性发热性疾病，具有很高的致死率，给养猪业带来巨大的经济损失。猪瘟的病原体为猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)。同属的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)与其高度同源。BVDV也感染猪引起临床疾病。BVDV和CSFV抗体存在交叉反应，给猪瘟的诊断带来困难。E2蛋白是瘟病毒一种结构蛋白，为主要的抗原，可以诱导宿主产生病毒中和抗体，对疫苗研发和检测方法建立具有重要的作用。
[0003]接种疫苗依然是目前控制猪瘟的最主要的方法之一。因为无法区分接种疫苗的动物和感染CSFV野毒株的动物(DIVA)是有效防控和最终根除猪瘟的主要困难。由于DIVA检测的需要，一系列的标记疫苗和相关血清学检测技术得到了发展。目前上市的嵌合的标记疫苗CP7
‑
E2alf也会诱导产生抗体的交叉反应。腺病毒/甲病毒复制载体疫苗和E2亚单位疫苗虽然具有避免抗体交叉反应的优势，但是它们的保护效果低于标记减毒活疫苗。研发新的标记疫苗需要有一种合适的DIVA检测方法，能够将接种疫苗的动物和感染野毒株的动物区分开，然而实施可靠的血清学DIVA检测仍然存在问题。基于E
rns
建立的ELISA方法可以用于标记疫苗的DIVA检测，但是依然会与BVDV E
rns
发生抗体的交叉反应；目前基于CSFV全长E2蛋白建立的ELISA方法也无法区分CSFV和BVDV血清抗体。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接ELISA方法及其应用，目的在于解决现有技术中的问题或至少解决现有技术中的一部分问题。
[0005]本专利技术是这样实现的，一种瘟病毒蛋白，所述瘟病毒蛋白为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列编码的CSFV E2截短蛋白CSFV
‑
tE2，和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示序列编码的BVDV E2截短蛋白BVDV
‑
tE2。
[0006]本专利技术还提供了如上述的一种瘟病毒蛋白在制备抗猪瘟病毒和/或牛病毒性腹泻病毒多克隆抗体试剂中的应用。
[0007]本专利技术还提供了如上述的一种瘟病毒蛋白在制备检测CSFV和/或BVDV抗体的试剂或试剂盒中的应用，特别是猪血清、兔血清和小鼠血清抗体。
[0008]本专利技术还提供了一种检测CSFV和/或BVDV抗体的试剂盒，包含如上述的瘟病毒蛋白。
[0009]本专利技术还提供了一种非诊断目的的检测CSFV和/或BVDV抗体的ELISA检测方法，
[0010]S1：CSFV
‑
tE2蛋白或BVDV
‑
tE2蛋白于低温条件下包被；
[0011]S2：甩干包被液后，加入PBST洗板，之后加入封闭液封闭；
[0012]S3：去除封闭液，加入PBST洗板，加入待测样品，孵育；
[0013]S4：去除样品后，加入PBST洗板，之后加入酶标二抗，孵育；
[0014]S5：弃掉二抗，加入PBST洗板，加入TMB溶液，恒温箱遮光显色；
[0015]S6：加入H2SO4终止液，用酶标仪测量在波长450nm处的吸收值，即OD
450nm
值。
[0016]进一步地，蛋白包被浓度为2.5μg/mL
‑
15μg/mL。
[0017]进一步地，待测样品为血清，稀释倍数为1：250
‑
4000。
[0018]进一步地，酶标二抗为羊抗鼠酶标二抗或兔抗猪酶标二抗。
[0019]本专利技术还提供了如上述的检测方法在非诊断目的的区分感染CSFV和BVDV的血清样品中的应用。
[0020]本专利技术还提供了如上述的检测方法在非诊断目的的区分接种用CSFV疫苗株的E2替换为BVDV的E2构建的重组嵌合疫苗株CSFV/BVDV
‑
E2的动物和感染CSFV野毒株的动物血清样品中的应用。
[0021]综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：
[0022]1、CSFV和BVDV的E2蛋白有约65％的氨基酸序列相同，是一种重要的抗原，能够诱导机体产生免疫反应以及抗体的交叉反应。目前，基于CSFV E2全部结构设计的ELSIA方法无法区分抗CSFV血清抗体和抗BVDV的血清抗体。
[0023]本申请中选择了CSFV E2第690～977位氨基酸区域以及BVDV E2第690～865位氨基酸区域，包含了各自保守的特异性抗原表位。选择大肠杆菌原核表达系统表达CSFV
‑
tE2(690～977)和BVDV
‑
tE2(690～865)两种目的蛋白。Western blot检测结果显示，CSFV
‑
tE2(690～977)和BVDV
‑
tE2(690～865)均正确表达。获得了高浓度、高纯度的两种蛋白并制备了抗CSFV
‑
tE2和抗BVDV
‑
tE2多克隆抗体。间接免疫荧光检测结果和Western blot结果均表明，制备的抗CSFV
‑
tE2和抗BVDV
‑
tE2多克隆抗体均具有良好的特异性。
[0024]Western blot结果证明了纯化的CSFV
‑
tE2能与CSFV抗体特异性结合，可用作包被抗原来检测猪血清、兔血清和小鼠血清的CSFV特异性抗体；纯化的BVDV
‑
tE2能与BVDV抗体特异性结合，可用作包被抗原来检测猪血清和小鼠血清的BVDV特异性抗体。
[0025]2、由于瘟病毒属的成员在基因组组成和抗原结构上具有很高的同源性，因此在检测CSFV和BVDV感染时，会发生血清交叉反应。检测病毒的金标准方法，如病毒分离，虽然可靠，但是耗时耗力，不适合筛选大量样本。目前可用的检测猪瘟的ELISA试剂盒大多基于CSFV E2全长设计的，会出现抗体的交叉反应，无法区分CSFV和BVDV的感染。
[0026]本申请中建立了一种新的ELISA方法，并对相关实验条件进行优化。本申请中获得了免疫后的小鼠血清以及从猪场采集的猪血清样本，确定了ELISA检测的Cut
‑
off值。包被CSFV
‑
tE2蛋白，ELISA检测小鼠血清的Cut
‑
off值为0.124，其灵敏度和特异性均为100％；ELISA检测猪血清样本的Cut
‑
off值为0.306，其灵敏度和特异性分别为95.5％和90.9％。包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种瘟病毒蛋白，其特征在于：所述瘟病毒蛋白为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的CSFV E2截短蛋白CSFV
‑
tE2编码序列，和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的BVDV E2截短蛋白BVDV
‑
tE2编码序列。2.如权利要求1所述的一种瘟病毒蛋白在制备抗猪瘟病毒和/或牛病毒性腹泻病毒多克隆抗体试剂中的应用。3.如权利要求1所述的一种瘟病毒蛋白在制备检测CSFV和/或BVDV抗体的试剂或试剂盒中的应用。4.一种检测CSFV和/或BVDV抗体的试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1中所述的瘟病毒蛋白。5.一种非诊断目的的检测CSFV和/或BVDV抗体的ELISA检测方法，其特征在于：S1：CSFV
‑
tE2蛋白或BVDV
‑
tE2蛋白于低温条件下包被；S2：甩干包被液后，加入PBST洗板，之后加入封闭液封闭；S3：去除封闭液，加入PBST洗板，加入待测样品，孵育；S4：去除样品后...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘兹书，朱鸿昌，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：