一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌，其是将具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列的目的片段克隆到表达载体中，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中制备获得。本发明专利技术公开了该表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌的应用。本发明专利技术还公开了一种微生物酶法拆分制备(R)

【技术实现步骤摘要】
一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌及其应用


[0001]本专利技术属于医药生物化工
，具体地说，是关于一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌及其拆分制备(R)
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氟
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色满
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羧酸的方法。

技术介绍

[0002]6‑
氟
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色满
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羧酸是重要医药中间体。化学名称是6
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氟
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3，4
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二氢
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2H
‑1‑
苯并吡喃
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甲酸，化学分子式是C
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H9O3F分子量是196.18，结构式为：
[0003][0004]在许多具有生物活性的分子结构中，都能发现6
‑
氟
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色满的色满结构单元的存在。譬如，该结构广泛包含在维生素E及许多拮抗β受体的抗高血压药中。光学纯的6
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氟
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色满
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羧酸用于新型降血压药物(S,R,R,R)
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奈必洛尔的合成。(S,R,R,R)
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奈必洛尔是第三代兼有血管扩张作用的心脏高度选择性β1受体阻滞剂，主要用于治疗原发性高血压，能有效地控制高血压和保持左心室功能，并且具有剂量低、副作用少，耐受性好等优点。
[0005]6‑
氟
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色满
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羧酸是制备奈必洛尔的关键中间体，其拆分效率决定制备奈必洛尔合成方法的最终结果。但是关于6
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氟
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色满
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羧酸(R)
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，(S)
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光学异构体拆分方法文献报道较少。迄今为止，化学方法、生物拆分法等是几种拆分有机酸常用的办法。文献曾有报道使用脱氢枞胺拆分外消旋的6
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氟
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3,4
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二氢
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2H
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苯并吡喃
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甲酸，总拆分收率经实验证明约为32％。此化学拆分方法过程较冗长，并且脱氢枞胺手性拆分试剂价格较贵，效率不高。EP2646426报道过利用来源于真菌Ophiostoma novo
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ulmi的酯酶拆分外消旋的6
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氟
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色满
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羧酸乙酯，分离纯化得到(R)
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氟
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色满
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羧酸，ee值是90.72％，转化率是50.28％。此类方法操作简便，条件温和。但是立体选择性不高。因此急需找到其他的高活性和高立体选择性的脂肪酶/酯酶。。基于此，开发了脂肪酶拆分制备(R)
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氟
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色满
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羧酸的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术以外消旋6
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氟
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色满
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羧酸甲酯为底物，利用离体的酯酶EstR或高效表达EstR的重组大肠杆菌的冻干菌体(fdcEstR)作为催化剂，选择性催化(R)
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氟
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色满
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羧酸甲酯的水解反应，由此制备获得光学纯的(R)
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氟
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色满
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羧酸，具有转化率高、立体旋转性强。因此本专利技术的第一个目的是提供一种表达酯酶ESTR的大肠杆菌基因工程菌。本专利技术的第二个目的是提供一种表达酯酶ESTR的大肠杆菌基因工程菌的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种微生物酶法拆分制备(R)
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氟
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色满
‑2‑
羧酸的方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]作为本专利技术的第一个方面，一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌，其是将具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列的目的片段克隆到表达载体中，获得重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中制备获得。
[0009]根据本专利技术，所述表达载体为pET
‑
28a(+)表达载体。
[0010]作为本专利技术的第二个方面，一种表达酯酶ESTR的大肠杆菌基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：
[0011]步骤一、提取热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strain BGSC 93A1的基因组DNA；
[0012]步骤二、以热链状地芽孢杆菌的EstR序列设计上下游引物，上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；
[0013]步骤三、以步骤一的热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strain BGSC 93A1的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到目的DNA片段，序列如SEQ ID NO.3所示；
[0014]步骤四、将目的DNA片段克隆到pET
‑
28a(+)表达载体，得重组质粒；
[0015]步骤五、将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌株。
[0016]作为本专利技术的第三个方面，一种含酯酶EstR基因的重组质粒，其是将具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列的目的片段克隆到表达载体中制备获得。
[0017]根据本专利技术，所述表达载体为pET
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28a(+)表达载体。
[0018]作为本专利技术的第四个方面，一种含酯酶ESTR基因的重组质粒的制备方法，包括如下步骤：
[0019]步骤一、提取热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strain BGSC 93A1的基因组DNA；
[0020]步骤二、以热链状地芽孢杆菌的EstR序列设计上下游引物，上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；
[0021]步骤三、以步骤一的热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strain BGSC 93A1的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到目的DNA片段，序列如SEQ ID NO.3所示；
[0022]步骤四、将目的DNA片段克隆到pET
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28a(+)表达载体，得重组质粒。
[0023]步骤五、将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌株。
[0024]作为本专利技术的第五个方面，一种酯酶EstR基因，其具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列。
[0025]作为本专利技术的第六个方面，一种酯酶EstR基因的制备方法，包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，其是将具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列的目的片段克隆到表达载体中，获得重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中制备获得。2.如权利要求1所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述表达载体为pET
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28a(+)表达载体。3.一种如权利要求1或2所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、提取热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strain BGSC 93A1的基因组DNA；步骤二、以热链状地芽孢杆菌的EstR序列设计上下游引物，上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；步骤三、以步骤一的热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strain BGSC 93A1的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到目的DNA片段，序列如SEQ ID NO.3所示；步骤四、将目的DNA片段克隆到pET
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28a(+)表达载体，得重组质粒；步骤五、将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌株。4.一种含酯酶EstR基因的重组质粒，其特征在于，其是将具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列的目的片段克隆到表达载体中制备获得。5.一种酯酶EstR基因，其具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列。6.一种如权利要求1或2所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌在酶法拆分制备(R)

【专利技术属性】
技术研发人员：高蓓，魏东芝，王风清，江敏，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：