内皮细胞-平滑肌细胞共培养的单流道微芯片模型的构建方法技术

本发明专利技术属于微流控技术领域，提出了一种内皮细胞

【技术实现步骤摘要】
内皮细胞
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平滑肌细胞共培养的单流道微芯片模型的构建方法


[0001]本专利技术属于微流控
，具体涉及一种内皮细胞
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平滑肌细胞共培养的单流道微芯片模型的构建方法。

技术介绍

[0002]心脑血管疾病是一类严重威胁人类健康的非传染性疾病，动脉血管狭窄是引起心脑血管疾病的因素之一，常见于冠状动脉粥样硬化等疾病中。血管内皮细胞与平滑肌细胞是血管壁的重要组成成分，在血管中扮演重要的角色，它们之间通过直接接触以及分泌物互相影响，联系密切。对于冠状动脉粥样硬化及其他心脑血管疾病的研究具有重要意义。
[0003]血管瘤、血管狭窄、动脉粥样硬化以及主动脉夹层等疾病的形成和发展与血液动力学参数的异常改变关系密切，如壁面切应力、剪应力梯度、振荡剪切指数。尤其是异常的血流剪切作用对内皮细胞及平滑肌细胞形态、功能以及基因表达的影响。
[0004]动脉血管壁从内向外依次为内膜、中膜和外模。内皮细胞是内膜的主要组成成分，其构成通透性屏障控制大分子物资的进出，同时具有一定的内分泌功能，其分泌的舒血管物质与缩血管物质相互制约，保持着动态平衡。血管平滑肌细胞是中膜的组成成分，其收缩与舒张可调节器官与组织的血流量。异常的血液流动引起的力学刺激改变将导致内皮形态改变以及分泌功能障碍。影响其接受信号因子，同样影响平滑肌细胞的级联信号的传导，很有可能诱发人体产生血管栓塞、动脉硬化等疾病。为了更好地研究流动剪切与内皮细胞形态和功能的相关性，在体外构建一个合适的模型至关重要。因此对于血管壁内皮细胞与血管壁平滑肌细胞的联合培养、细胞形态、分泌功能的研究显得尤为重要。
[0005]然而传统的培养方法虽然可以培养血管内皮细胞并模拟血管内皮细胞的生存环境但无法真实的模拟体内的生存尺寸，也无法观察判断血流剪切力对血管内皮细胞与平滑肌细胞形态与功能的改变。此外，动物模型虽然能够通过外界干预的手段诱导流动异常改变，进而考察血管内皮细胞形态和功能的改变，但是动物体内实验的流动存在不可操控、个体差异性，同时受到动物伦理等多方面的制约。
[0006]微芯片通道技术，可实现流动环境的连续可控、培养单元的相互连通，以及三维细胞培养，利用微芯片通道取代临床前动物实验进行药代动力学的研究已逐渐成为新的研究热点。微芯片通道模型采用光刻或软光刻的技术，将生化实验室中涉及的基本操作单元集中在一块微小的芯片上，微通道芯片技术相对于传统的动物实验相比成本更低，实验的周期短，微通道芯片技术的操作更加简单。结构改变和流动控制相对容易，易于实现不同结构诱导的流动剪切刺激的改变。细胞形态的观测更加直接便捷，通过引入适当的生物抗体，可以实现细胞功能的检测。更为重要的是微尺度下流体独有的效应能够有效地提高微通道分析速率及准确性。此外，微通道芯片实验可以避免动物实验中的动物与人类非同源时带来的研究误差。
[0007]但大多实验状态下的基于微通道芯片培养的细胞只能满足单层培养，培养种类单
一，无法模拟不同细胞之间的相互作用关系，无法在血流动力学下同时模拟多种细胞形态、功能、分泌物质的变化。无法得出多种细胞在体内的真实物理环境及生理表现。因此构建一种基于血流动力学，同时模拟两种细胞之间形态、功能关系的模型显得格外重要。
[0008]专利申请：一种基于背面发散式光刻技术的弧形截面血管网络微通道模板及制作方法，申请号CN201911268757.8。其主要问题存在于：该专利所声明的制作方法虽然可以制作高度不一致的血管模型，但是该模型仅仅从物理外观上模拟了血管网络，无法在生理基础上模拟真实的血管内部环境，无法模拟不同血管细胞之间的相互作用。
[0009]专利申请：一种动态检测力学微环境中细胞黏附的实验装置，申请号CN202110451602.9。其主要问题存在于：该专利虽然能够精确地调整流体剪切力的强度、方向、角度及模式并对内皮细胞或肿瘤细胞进行动态的观察，但是无法同时对内皮细胞和肿瘤细胞进行模拟，因而无法模拟两细胞彼此之间的影响，进而无法得出两细胞之间的细胞因子浓度。

技术实现思路

[0010]本专利技术要解决的技术问题是提出一种可以在微流动通道内实现内皮细胞与平滑肌细胞共同培养的物理模型的制作方法。该模型的提出克服了单一微通道内内皮细胞与平滑肌细胞无法共同生长的难题，可以解决在同一流动刺激下实时同步观测两种细胞形态、功能检查、以及细胞间相互作用等技术问题。
[0011]本专利技术的技术方案如下：
[0012]一种内皮细胞
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平滑肌细胞共培养的单流道微芯片模型的构建方法，包括以下步骤：
[0013]步骤1、绘制包含血管区域1及其周围限位孔结构2的结构模型；形状和宽度根据所模拟的血管结构和直径确定；
[0014]步骤2、纯黑色填充于结构模型之外的区域；
[0015]步骤3、根据步骤2得到的模型利用光刻技术制作阳模1#3和阳模2#4，二者血管尺寸及形状相同，阳模2#4中血管高度高于阳模1#3；
[0016]步骤4、按照质量比A:B＝1：1混合配制AB双组份透明硅橡胶溶液；充分混合后抽真空至硅橡胶溶液成无色透明；
[0017]步骤5、清洁阳模；
[0018]步骤6、抽真空后的硅橡胶溶液浇筑在阳模2#4上至硅胶液固化取下阳模2#4，得到硅胶模片5；
[0019]步骤7、硅胶膜片5与阳模1#3配合，硅胶模片5与阳模1#3的血管区域1之间插入进口微管6和出口微管8，形成微通道I7；
[0020]步骤8、对微通道I7内表面进行灭菌处理，并进行消毒和灭菌；利用高温高压设备对微通道模型内表面进行灭菌处理，并放置在紫外光下进行消毒和灭菌；
[0021]步骤9、利用微泵将生物试剂注入微通道I7中直至生物试剂充满微通道I7，对微通道模型血管内壁进行浸润处理；步骤10、微通道I7置于37℃细胞孵箱内干燥10～15分钟使其内表面干燥，以增强硅胶表面与细胞的联接能力，使得内皮细胞与平滑肌细胞在微通道模型表面更易贴附生长；
[0022]步骤11、将平滑肌细胞与BD
‑
Matrixgel基质胶溶液混合均匀得到平滑肌细胞
‑
基质溶液，其中平滑肌细胞的密度大于1
×
107个/mL；以2
‑
10μL/min的流速将平滑肌细胞
‑
基质溶液注入到微通道I7内，直至其充满整个微通道I7；
[0023]步骤12、将平滑肌细胞
‑
基质溶液于恒温箱保持32
‑
42℃的恒定环境中，保持10
‑
40min后，形成具有一定弹性的基质胶凝内平滑肌细胞层15；
[0024]步骤13、取下阳模1#3，将带有进出口的盖玻片13与含有基质胶凝内平滑肌细胞层15的硅胶膜片5贴合形成微通道II14；
[0025]步骤14、配制内皮细胞密度大于1
×
107个/mL的内皮细胞培养液，将其注入到微通道II14内，内皮细胞将在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种内皮细胞
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平滑肌细胞共培养的单流道微芯片模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、构建包含血管区域(1)及其周围限位孔结构(2)的结构模型；步骤2、用纯黑色填充于结构模型之外的区域；步骤3、根据步骤2得到的结构模型利用光刻技术制作阳模1#(3)和阳模2#(4)，二者血管尺寸及形状相同，阳模2#(4)中血管高度高于阳模1#(3)；步骤4、按照质量比A:B＝1：1混合配制AB双组份透明硅橡胶溶液；充分混合后抽真空至硅橡胶溶液成无色透明；步骤5、清洁阳模；步骤6、抽真空后的硅橡胶溶液浇筑在阳模2#(4)上至硅胶液固化取下阳模2#(4)，得到硅胶模片(5)；步骤7、硅胶膜片(5)与阳模1#(3)配合，硅胶模片(5)与阳模1#(3)的血管区域(1)之间插入进口微管(6)和出口微管(8)，形成微通道I(7)；步骤8、对微通道I(7)内表面进行灭菌处理，并进行消毒和灭菌；步骤9、将生物试剂注入微通道I(7)中直至生物试剂充满微通道I(7)；步骤10、微通道I(7)置于37℃细胞孵箱内干燥10～15分钟使其内表面干燥；步骤11、将平滑肌细胞与BD
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Matrixgel基质胶溶液混合均匀得到平滑肌细胞
‑
基质溶液，其中平滑肌细胞的密度大于1
×
107个/mL；以2
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10μL/min的流速将平滑肌细胞
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基质溶液注入到微通道I(7)内，直至其充满整个微通道I(7)；步骤12、将平滑肌细胞
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基质溶液于恒温箱保持32
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42℃的恒定环境中，保持10
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40min后，形成具有一定弹性的基质胶凝内平滑肌细胞层(15)；步骤13、取下阳模1#(3)，将带有进出口的盖玻片(13)与含有基质胶凝内平滑肌细胞层(15)的硅胶膜片(5)贴合形成微通道II(14)；步骤14、配制内皮细胞密度大于1
×
107个/mL的内皮细胞培养液，将其注入到微通道II(14)内，直至内皮细胞(16)在平滑肌细胞
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基质胶表面贴附生长。2.根据权利要求1所述的内皮细胞
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平滑肌细胞共培养的单流道微芯片模型的构建方法，其特征在于，所述阳模1#(3)和阳模2#(4)高度分别为50微米和100微米，二者均为玻璃基底。3.根据权利要求1或2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：母立众，张宇恒，潘悦，刘小龙，迟青卓，龙丽丽，孙傲然，贺缨，赵广，贺宇馨，孙毓，龙骏彦，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：