一种检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的引物探针及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的引物探针，主要是利用热稳定的DNA聚合酶（可具有5

【技术实现步骤摘要】
一种检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的引物探针及方法
[0001]
：本专利技术属于核酸检测
，特别涉及一种检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的引物探针及方法。
[0002]
技术介绍
：2016年结核病仍是全球第十大死因，尤其在低收入和中低收入国家，该死因排名更靠前，结核病目前仍是全球对人类最具威胁的传染病之一。据WHO肺结核报告统计估算，全球结核潜伏感染人群约17亿，占全人群的1/4左右。2018年全球约1000万人患有肺结核，各国结核病负担差异较大，发病率分布在低于5/10万到部分国家高于500/10万之间，平均约130/10万人。从地理位置看，主要分布在东南亚（44%）、非洲（24%）、西太平洋地区（18%）、东地中海（8%）、美洲（3%）和欧洲（3%）；从国家分布看，30个结核病高负担国家的新发患者依然占到了全球新发患者数的87%，其中印度（27%）、中国（9%）、印度尼西亚（8%）、菲律宾（6%）、巴基斯坦（6%）、尼日利亚（4%）、孟加拉国（4%）和南非（3%）等8个国家的新发患者约占全球的2/3。中国的估算结核病新发患者数为86.6万（2017年88.9万），估算结核病发病率为61/10万（2017年63/10万），在30个结核病高负担国家中估算结核病发病率排第28位，高于俄罗斯（54/10万）和巴西（45/10万）。
[0003]结核耐药仍然是很严重的公共问题，2018年全球约有48.4万新增结核病例出现利福平耐药（其中78%为耐多药），约3.4%的新增病例和18%的既往治疗病例出现耐多药或耐利福平（MDR/RR
‑
TB），根据已发现的病原学阳性肺结核患者数计算的中国利福平耐药肺结核患者数约为2.5万。鉴定结核耐药的方法主要是结核菌耐药性试验、分子快速测试和测序法。传统的结核菌耐药试验检测方法主要依据细菌生长，操作复杂，培养周期至少4周以上；测序法可以检测到各种未知突变及突变性质，但一代测序的灵敏度不够，二代测序则费用太高。因此有必要建立一种快速鉴定结核耐药基因的方法，能够指导结核病人科学合理有效用药。目前鉴定结核分枝杆菌耐药基因的分子生物学方法主要是利用不对称PCR扩增的熔解曲线法和反向斑点杂交法（RBD），其中反向斑点杂交法（RBD）是将PCR技术和反向点杂交技术相结合的一种可以检测耐药突变的生物学方法，由于需要在正常PCR扩增后进行杂交、洗膜和显色等步骤，因此操作复杂，总检测时间也较长。不对称PCR熔解曲线分析法操作简单，检测灵敏度高，应用更广泛。
[0004]公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0005]
技术实现思路
：本专利技术的目的在于采用一种热稳定的DNA聚合酶（可具有5
’
核酸酶活性）和不对称PCR法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药基因多个突变位点检测，从而克服上述现有技术中的缺陷。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了一种检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的引物探针，包括：依据结核分枝杆菌81bp耐药核心区域，设计SEQ ID No.1～No.2的引物、
No.6，探针SEQ ID No.3，SEQ ID No.5和SEQ ID No.8的浓度为100~500nmol；所述引物混合液B含有上述的4条特异性引物具体为：SEQ ID No.1~2，SEQ ID No.9~10和2条探针具体为：SEQ ID No.4和SEQ ID No.11，其中，引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.9的浓度为10~50 nmol、引物SEQ ID No.2和SEQ ID No.10及探针SEQ ID No.4和SEQ ID No.11的浓度为100~500nmol所述反应液含有0.1~1mM dNTPs、2
×
PCR反应缓冲液、2~4mM MgCl2；所述DNA聚合酶可为普通 Taq DNA聚合酶，浓度为1~5U/
µ
l。
[0012]优选地，上述技术方案中，PCR扩增及熔解曲线分析程序如下:步骤一：37℃ 5min, 1个循环;步骤二：95℃ 10min, 1 个循环;步骤三：95℃ 10s, 60℃ 10~15s, 72℃ 20~30s, 15 个循环;步骤四：95℃ 10s, 55℃ 10~15s, 72℃ 20~30s, 35 个循环, 72℃收集FAM、VIC/HEX/JOE、ROX、CY3、CY5等通道荧光信号;步骤五：95℃ 20s, 40℃~80℃，每1℃收集FAM、VIC/HEX/JOE、ROX、CY3、CY5等通道荧光信号。
[0013]优选地，上述技术方案中，Tm值的变化判断具体为：对上述反应体系进行荧光定量PCR不对称扩增和熔解曲线分析，当检测样品的Tm值低于对照管2℃以上时，可判读为结核分枝杆菌耐药突变；当检测样品出现双峰，一个峰Tm值与对照Tm值一致（差异小于1），一个峰Tm值低于对照Tm值2℃以上时，可判读为结核分枝杆菌杂合耐药突变。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术的突变设在探针上，为了增加探针的分辨率，对探针上的碱基序列引入部分碱基突变，以更容易区分耐药突变。
[0015]以上所述方法，应保证体系中探针过量，经PCR扩增剪切后剩余的探针可与生成的产物单链DNA进行熔解曲线分析。
[0016]附图说明：图1是A反应管检测结核分枝杆菌RpoB基因野生型和516位点耐药突变熔解曲线分析。
[0017]图2是A反应管检测结核分枝杆菌RpoB基因野生型和531位点耐药突变熔解曲线分析。
[0018]图3是A反应管检测结核分枝杆菌KatG基因野生型和315位点耐药突变熔解曲线分析。
[0019]图4是B反应管检测结核分枝杆菌RpoB基因野生型和526位点耐药突变熔解曲线分析.图5是B反应管检测结核分枝杆菌mabA(fabG1)
‑
inhA启动子基因野生型和
‑
15位点耐药突变熔解曲线分析。
[0020]图6是A反应管检测结核分枝杆菌RpoB基因516位点50%耐药突变熔解曲线分析。
[0021]图7是A反应液管检测结核分枝杆菌异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品N1
‑
N10的熔解曲线分析图谱。
[0022]图8是B反应液管检测结核分枝杆菌异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品N1
‑
N10的熔解曲线分析图谱。
[0023]图9
‑
图11是检测结核分枝杆菌异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品不同浓度，不同耐药比例下的katG S315T1位点熔解曲线分析图谱。
[0024]具体实施方式：下面对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护 范围并不受具体实施方式的限制。
[0025]除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包 括”或其变换本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的引物探针，其特征在于：包括：依据结核分枝杆菌81bp耐药核心区域，设计SEQ ID No.1～No.2的引物、SEQ ID No.3～No.5的探针，共覆盖检测利福平耐药RpoB基因511、513、516、522、526、531和533位点；依据异烟肼耐药KatG基因区域设计SEQ ID No.6～No.7的引物、SEQ ID No.8的探针，覆盖检测KatG基因315位点；依据mabA(fabG1)
‑
inhA启动子基因区域设计SEQ ID No.9～No.10的引物、SEQ ID No.11的探针，覆盖检测mabA(fabG1)
‑
inhA启动子基因
‑
17、
‑
15和
‑
8位点。2.根据权利要求1所述的检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的引物探针，其特征在于：探针5
’
端可分别采用FAM、VIC/HEX/JOE、ROX、CY3、CY5等进行荧光素标记，3
’
端可采用BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、TAMRA等猝灭荧光基团。3.一种检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的试剂盒，包括引物探针反应液，其特征在于：所述引物探针反应液包括A反应管和B反应管，其中A反应管包括针对RpoB基因的1对引物和2条探针，针对KatG基因的1对引物和1条探针；B反应管包括针对RpoB基因的1对引物和1条探针，针对mabA(fabG1)
‑
inhA启动子基因区域的1对引物和1条探针。4.根据权利要求3所述的检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的试剂盒，其特征在于：A反应管中：RpoB基因1的1对引物和2条探针具体为SEQ ID No.1～No.2的引物、SEQ ID No.3～No.4的探针；KatG基因的1对引物和1条探针具体为SEQ ID No.6～No.7的引物、SEQ ID No.8的探针。5.根据权利要求3所述的检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的试剂盒，其特征在于：B反应管中：RpoB基因1的1对引物和1条探针具体为SEQ ID No.1～No.2的引物、SEQ ID No.5的探针；mabA(fabG1)
‑
inhA启动子基因区域的1对引物和1条探针具体为SEQ ID No.9～No.10的引物、SEQ ID No.11的探针。6.一种快速鉴定结核分枝杆菌耐药基因的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：模板DNA的提取：提取待检样品的DNA，所述待检样品是已鉴定为含有结核分枝杆菌的痰液样品或分离培养物；不对称PCR反应：在200
µ
l PCR管配制两组20
µ
l反应体系：引物混合液A 8
µ
l，核酸扩增反应液 9
µ
l，DNA聚合酶0.9<...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭玉婉，张蓉，赵西浩，张少铎，刘雪芹，贺华，陈永红，彭莉，苏波，李秀林，刘中华，王国强，
申请(专利权)人：江苏硕世生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：