一种PCR法快速评价哺乳动物细胞质量的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及细胞鉴定领域，尤其涉及一种PCR法快速评价哺乳动物细胞质量的试剂盒及其检测方法。本发明专利技术的试剂盒中包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1～12所示的引物。本发明专利技术选择了普遍可能污染细胞的类型中保守性较高的片段作为引物，可对细胞物种和类型进行检测，检测时间短，能快速得出结果，能得出准确对感染的细菌、支原体、细胞生长质量或细胞交叉感染类型及性别，方便进行后续实验处理或防护，检测范围广，可对多项可能污染细胞的类型进行检测，减少污染或假阳性的可能，可对细胞系需进行全面鉴定。面鉴定。面鉴定。

【技术实现步骤摘要】
一种PCR法快速评价哺乳动物细胞质量的试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及细胞鉴定领域，尤其涉及一种PCR法快速评价哺乳动物细胞质量的试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]体外培养的细胞越来越广泛的用于科学研究和生产中。同时交叉污染细胞的使用日趋严重，已严重影响了科学研究的质量和产品质量。在研究之用外，培养细胞还被用于疾病诊断和生物活性物质的生产，其细胞质量的优劣就尤其重要。因此引起了学者们的广泛关注，提出了质量要求。当前提出研究用细胞系需进行全面鉴定。
[0003]目前体外培养细胞在使用中存在的核心问题是：病原体、微生物污染、细胞交叉污染或鉴定错误以及由于细胞过度传代造成遗传信息改变。这些变化的原因主要是：细胞培养操作技术不规范、细胞来源不清、传代数不清、引入的细胞错误等等。
[0004]支原体污染是细胞培养过程中易出现、难避免、难发现的问题。当细胞(特别是传代细胞)被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉。
[0005]支原体检测一般采用以下几种方法：
[0006]1.培养法：是最传统的支原体污染检测方法，也是最早的检测方法，基本实验步骤首先是将细胞培养物置于支原体肉汤液体培养基中，37℃培养3天后离心，将沉淀物转移至支原体固体琼脂培养基中，相同条件下培养，观察培养基中若有类似煎鸡蛋样菌落出现，则细胞被支原体污染了。
[0007]2.DNA荧光染色法：利用荧光试剂Hoechst 33258等标记细胞和支原体DNA，荧光染料会结合到DNA的A
‑
T富集区域，因为支原体DNA中A
‑
T含量占多数，所以可将其染色，染料在紫外光激发下产生黄绿色荧光，利用荧光显微镜观察支原体是否存在。正常细胞核区见边缘整齐清晰的荧光，胞质区无荧光。被支原体污染的细胞不仅在细胞核而且在细胞核外及细胞膜上均可见许多大小均一之荧光小点，即为支原体DNA，证明细胞被支原体污染了。
[0008]3.PCR(Polymerase Chain Reaction)检测支原体方法：支原体作为一种原核生物，其rRNA基因是由保守和多变序列间隔排列而成，能够作为生物分类的指标。PCR以4种dNTP为底物，在引物存在的情况下，在DNA模板的3
’
末端进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板核酸得到指数级的扩增。PCR检测方法尤其适用于培养困难而且耗时的支原体的检测鉴定。
[0009]4.荧光定量PCR方法：荧光定量PCR是在常规PCR基础上加入荧光探针或相应的荧光染料来实现实时定量的。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。在实时荧光定量PCR技术中Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的
对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
[0010]细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染。一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。
[0011]培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变而呈现黄色。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。一般细菌污染进程很快，大约污染一两天后肉眼就能显著观察到。细菌检测一般采用以下几种方法：
[0012]1.肉眼观察：细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到。
[0013]2.接种观察：采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。
[0014]3.显微镜下观察：在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染；若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。
[0015]4.测序验证：取适量培养液提基因组送测序，然后分析测序结果。
[0016]细胞交叉感染检测一般采用以下几种方法：
[0017]细胞培养操作技术不规范、细胞来源不清、传代数不清、引入的细胞错误使用了交叉污染或错误辨识的细胞而导致研究结论错误、结果不可重复、临床细胞治疗灾难性后果，这浪费大量时间、精力和金钱。
[0018]因此近年NIH、ATCC、Nature和Science等对此多次发出呼吁，要求研究者对细胞进行鉴定，如2011年美国国家标准学会专门颁布了一份细胞STR鉴定国家标准；2014年12月、2015年2月Science杂志分别发表文章专题阐述细胞交叉污染和错误辨识严重性；2015年4月Nature通知：Nature旗下杂志将从5月开始要求作者鉴定论文中所用细胞系；2015年6月有报道称一科学家由于用错细胞系，撤销Nature论文。
[0019]1.同工酶谱检测法：由于不同种属来源的细胞在同工酶谱分布上具有差异，通过凝胶电泳分离后，对电泳带型和相对迁移距离进行检测，可用于细胞交叉污染的检测。同工酶谱检测法适用于种属间的细胞交叉污染检测。采用同工酶谱检测法进行细胞交叉污染检测时，检测葡萄糖
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磷酸脱氢酶(G6PD)、乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MD)和核营磷酸化酶(NP)是十分重要的。若待检细胞样品的同工酶迁移率与标准对照品不一致或者存在多个酶谱条带，可以判定该细胞样品存在种属间的细胞交叉污染。
[0020]2.HLA基因型检测法：HLA因其高度多态性而成为最能代表个体特异性并伴随个体终身的稳定的遗传标志，在无关个体之间HLA型别完全相同的几率极低，因此通过检测细胞的HLA基因型可以确定细胞是否存在交叉污染。由于HLA基因型只存在人体中，HLA基因分型检测法适用于不同人源细胞之间(种属内)的交叉污染检测。HLA基因型检测法宜采用序列
特异性引物进行PCR扩增，并结合第二代测序技术进行HLA高分辨的分型检测。若待检细胞样品的HLA基因分型结果与目标细胞存在明显差异，可以判定该人源细胞存在种属内细胞交叉污染。
[0021]3.细胞形态分析：细胞形态检测法一般通过对细胞生长形态、生长特性等特征进行检测，初步判断是否发生细胞交叉污染。细胞形态检测法适用于贴壁生长的细胞发生的交叉污染检测，不适用于悬本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PCR法快速评价哺乳动物细胞质量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1～12所示的引物。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Taq Pro Multiplex DNA聚合酶。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有2
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Multiplex缓冲液。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述2
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Multiplex缓冲液包括：酶反应buffer、2mM dNTPs和25mM MgSO4。5.一种PCR法快速评价哺乳动物细胞质量的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用...

【专利技术属性】
技术研发人员：林锦梅，陈少锐，
申请(专利权)人：广州烨善生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：