用于检测粪便样品中的罕见DNA序列的方法技术

本公开提供用于鉴定粪便样品中的低拷贝数DNA序列(如来自致病性细菌物种或与疾病相关的遗传变体的低拷贝数DNA序列)的方法和材料。料。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测粪便样品中的罕见DNA序列的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请案要求2019年5月23日提交的美国专利申请案第62/852,018号的权益和优先权，所述美国专利申请案以全文引用的方式并入本文中。


[0003]本公开大体上提供用于检测粪便样品中的罕见DNA序列的方法和组合物。
[0004]序列表
[0005]本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式以电子方式提交并且通过全文引用的方式特此并入。2020年5月26日创建的所述ASCII拷贝命名为“116110
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5005
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WO_ST25_Sequence_Listing”，并且大小为8千字节。

技术介绍

[0006]粪便是容易获得且丰富的代谢废物的来源。它含有驻存在哺乳动物胃肠道中的数万亿个微生物，以及数百万个宿主细胞，包括在肠腔和血液循环之间迁移的巨噬细胞和淋巴细胞。关于人肠道微生物群的大量知识表明，胃肠道中细菌分类群的组成对于体内稳态和疾病是重要的，其中许多病症来自神经学、精神病学、呼吸、心血管、胃肠道、肝、自身免疫、代谢和肿瘤学领域。此外，存在于粪便中的异常宿主细胞具有疾病的遗传特征。因此，粪便为病原体检测、肠道微生物群分析和疾病诊断的提供了有价值、非侵入性的生物材料来源，并且对于应用于诊断、疾病预测和治疗干预具有宝贵的潜力。
[0007]常规的粪便分析方法包含与生物化学、免疫化学、遗传(DNA或RNA)和/或显微镜分析组合的微生物培养。然而，粪便材料的基于培养的方法受到限制，因为一些粪便微生物难以培养，并且粪便中大部分正常共生细菌呈现高背景，从而可能排除对较稀有物种的检测。此外，微生物培养不利于分析粪便样品中少量的宿主物质。
[0008]某些遗传技术扩增靶材料，并且因此不需要培养，包括PCR、定量PCR和DNA/RNA测序。特别值得一提的是，下一代测序(NGS)有助于评估在序列水平上具有复杂微生物群落的标本中的基因和基因组。然而，这些方法也由于来自样品中存在的正常细菌的DNA的高背景而复杂化。粪便中DNA的最大部分来自正常的肠道微生物群，占粪便干重的60
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70％。因此，当在粪便样品上进行猎枪NGS时，从正常的肠道微生物群生成大量背景、非信息化读取，使准确检测和分析复杂化或无法进行准确检测和分析，并且增加了成本。此外，粪便是获得高质量DNA和RNA用于分子分析的最困难的生物标本之一，因为它含有大量降解DNA和RNA的核酸酶，以及干扰后续分子分析的各种核酸污染物，和阻碍后续PCR扩增和NGS程序的许多抑制剂。
[0009]因此，所属领域需要检测粪便样品中的罕见(例如，低拷贝数)DNA物质的方法，以及用于进行这些方法的组合物。

技术实现思路

[0010]本公开涉及用于鉴定粪便样品中的低拷贝数DNA序列的方法和材料，包括例如来自致病性细菌物种的低拷贝数DNA序列。在一些实施方案中，本公开涉及鉴定粪便样品中与疾病例如癌症相关的低拷贝数遗传变体。在其它实施方案中，本公开涉及用于富集低拷贝数DNA序列的方法，以用于通过定量或半定量手段进行检测或通过测序来检测。本公开还涉及用于制备包含来自粪便样品的低拷贝数DNA序列的测序文库的方法和组合物。另外，本公开涉及用于使用标记的寡核苷酸耗尽样品中丰富的细菌物种的组合物和试剂盒。
[0011]在上述或下述实施方案中的每一个或其中的任一个的一些实施方案中，本公开提供用于鉴定粪便样品中的低拷贝数DNA序列的方法和组合物，其包含从受试者获得粪便样品；从粪便样品中提取DNA以获得DNA制备物；将标记的寡核苷酸探针与DNA制备物中的非致病性细菌DNA序列杂交以形成杂交复合物；从DNA制备物中耗尽杂交复合物；以及鉴定所述DNA制备物中所述低拷贝数DNA序列的存在，其中所述DNA制备物中的所述低拷贝数DNA序列的鉴定指示所述低拷贝数DNA序列存在于所述粪便样品中。
[0012]在上述或下述实施方案中的每一个或其中的任一个的一些实施方案中，本公开提供用于鉴定来自致病性细菌物种，如幽门螺旋杆菌(H.pylori)DNA序列的低拷贝数DNA序列的方法和组合物。在其它实施方案中，根据本公开鉴定的低拷贝数DNA序列是人DNA序列，如疾病相关的遗传变体。在某些实施方案中，疾病相关的遗传变体与癌症(例如结肠癌)相关。
[0013]在上述或下述实施方案中的每一个或其中的任一个的一些实施方案中，本公开提供用于耗尽存在于粪便样品中的一个或多个非致病性细菌物种的DNA序列的方法和材料，其中所述非致病性细菌物种包含拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)，或其组合。在一些实施方案中，非致病性细菌物种包含拟杆菌属，包括脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产黑色素拟杆菌(Bacteroides melaninogenicus)、口腔拟杆菌(Bacteroides oralis)或其组合。
[0014]在上述或下述实施方案中的每一个或其中的任一个的一些实施方案中，本公开提供用于鉴定粪便样品中的低拷贝数DNA序列的方法和组合物，其包含将标记的寡核苷酸探针与DNA制备物中的非致病性细菌DNA序列杂交，以形成杂交复合物。在一些实施方案中，标记的寡核苷酸探针与非致病性细菌DNA的保守区互补。在其它实施方案中，标记的寡核苷酸探针包含生物素标记。
[0015]在上述或下述实施方案中的每一个或其中的任一个的一些实施方案中，本公开还提供用于耗尽存在于粪便样品中的一个或多个非致病性细菌物种的DNA序列的方法和材料，其包含将生物素标记的杂交复合物与涂布有链霉亲和素的底物一起温育。在某些实施方案中，所述涂布有链霉亲和素的底物包含珠粒、柱或膜。在一些实施方案中，涂布有链霉亲和素的底物包含磁珠，并且使用磁场从DNA制备物中耗尽杂交复合物。在一些实施方案中，使用离心力从DNA制备物中耗尽本公开的杂交复合物。
[0016]在上述或下述实施方案中的每一个或其中的任一个的一些实施方案中，本公开的标记的寡核苷酸探针选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。
[0017]在上述或下述实施方案中的每一个或其中的任一个的一些实施方案中，鉴定DNA制备物中低拷贝数DNA序列的存在包含对DNA序列进行测序。在某些实施方案中，鉴定DNA制
备物中低拷贝数DNA序列的存在包含定量PCR反应。在其它实施方案中，测序或定量PCR反应与由多个粪便样品制备的DNA多路复用(multiplexing)。
[0018]在上述或下述实施方案中的每一个或其中的任一个的一些实施方案中，从粪便样品中提取DNA以获得DNA制备物包含在裂解缓冲液中使粪便样品珠粒均质化，其中所述裂解缓冲液包含能够破坏细菌细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种鉴定粪便样品中的低拷贝数DNA序列的方法，其包含：从受试者获得所述粪便样品；从所述粪便样品中提取DNA以获得DNA制备物；将标记的寡核苷酸探针与所述DNA制备物中的非致病性细菌DNA序列杂交以形成杂交复合物；从所述DNA制备物中耗尽所述杂交复合物；以及鉴定所述DNA制备物中所述低拷贝数DNA序列的存在，其中所述DNA制备物中所述低拷贝数DNA序列的鉴定指示所述低拷贝数DNA序列存在于所述粪便样品中。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述低拷贝数DNA序列是幽门螺旋杆菌(H.pylori)DNA序列。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述低拷贝数DNA序列是人DNA序列。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述人DNA序列与癌性或癌前病况相关。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述非致病性细菌DNA来自拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)，或其组合。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记的寡核苷酸探针与所述非致病性细菌DNA的保守区互补。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记是生物素。8.根据权利要求7所述的方法，其还包含将生物素标记的杂交复合物与链霉亲和素涂布的底物一起温育。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述链霉亲和素涂布的底物包含珠粒、柱或膜。10.根据权利要求8所述的方法，其中所述链霉亲和素涂布的底物包含磁珠，并且其中使用磁场从所述DNA制备物中耗尽所述杂交复合物。11.根据权利要求1所述的方法，其中使用离心力从所述DNA制备物中耗尽所述杂交复合物。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述非致病性细菌DNA来自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产黑色素拟杆菌(Bacteroides melaninogenicus)、口腔拟杆菌(Bacteroides oralis)或其组合。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述标记的寡核苷酸探针选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。14.根据权利要求1所述的方法，其中鉴定低拷贝数DNA序列还包含对所述DNA序列进行测序。15.根据权利要求1所述的方法，其中鉴定低拷贝数DNA序列包含定量PCR反应。16.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：美国分子实验室公司，
类型：发明
国别省市：