一种对动物布鲁氏菌病的通用快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种通用快速检测动物布鲁氏菌病的引物、探针及检测方法，其中引物和探针适用于RAA荧光法检测，可实现在33℃条件下20分钟内完成动物布鲁氏菌核酸的检测；与猪链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、牛分枝杆菌核酸样本无交叉反应，特异性达100％；检测方法快速、容易实现高通量，同时降低了检测时间和检测成本，本发明专利技术提供的基于RAA荧光法通用快速检测动物布鲁氏菌病病原的方法，灵敏度高，反应检测灵敏度在35％的概率下达到56copies/反应。率下达到56copies/反应。率下达到56copies/反应。

【技术实现步骤摘要】
一种对动物布鲁氏菌病的通用快速检测方法


[0001]本专利技术属于细菌分子生物学检测
，具体涉及一种对动物布鲁氏菌病的通用快速检测方法。

技术介绍

[0002]布鲁氏菌病(Brucellosis)，简称布病，是由布鲁氏菌引起的慢性多器官损伤性人兽共患传染病，WHO将其视为“世界范围内流行最广泛的人兽共患病，但也是最易被人们所忽视的7种重要传染病之一”，世界动物卫生组织(OIE)将布病列为必须通报动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。可感染牛、羊、猪、犬、骆驼、鹿等60多种动物，严重影响动物卫生与公共卫生安全。人主要通过直接接触、消化道、呼吸道等途径感染布鲁氏菌。2012年，我国发布《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》，将布鲁氏菌病列为16种优先防治动物疫病病种。
[0003]动物感染后常表现高热、出汗、乏力、关节痛等。感染布病后动物的繁殖能力和生产性能会下降，母畜会流产、不孕、胎盘滞留、死胎或弱胎，公畜会患睾丸炎、关节炎等。人感染后，患者反复发热，少部分患者仅表现为低热，部分患者可出现典型的波状热，即体温逐渐上升达39℃及以上，数天后又逐渐下降到正常水平，持续数天后又逐渐升高，如此反复多次。其他常见症状包括大汗、乏力、关节痛、肌痛、厌食、体重下降、抑郁，以及肝、脾、淋巴结肿大等。
[0004]布病流行于170多个国家和地区，主要流行于中东、拉丁美洲、亚洲、非洲和地中海盆地等牛羊养殖集中但经济技术相对落后的地区，每年约有50万新发人间病例，造成的经济损失约30亿美元。我国当前人兽共患布病感染形势仍十分严峻。动物布病专项流调结果显示，牛羊总体布病个体阳性率为3.2％，群体阳性率为25％。
[0005]根据布病的流行特点、临床表现可以初步判断为疑似布病，确诊则要采集病料进行实验室检测。布鲁氏菌病原学检测可以进行细菌分离培养和PCR检测。血清学检测技术有虎红平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验、全乳环状试验、酶联免疫吸附试验、荧光偏振分析技术等。但是，缺乏能够在养殖场、屠宰场、野外等现场环境快速感知、识别动物布鲁氏菌病(牛种、羊种、猪种、犬种)病原的通用检测方法。

技术实现思路

[0006]鉴于此，本专利技术提供了一种基于重组酶等温扩增荧光法(RAA荧光法)检测动物布鲁氏菌病(牛种、羊种、猪种、犬种)的通用引物、探针及检测方法，可实现在39℃条件下20分钟内完成动物布鲁氏菌病的检测，具有快速、灵敏、操作简便、满足现场快速检测的需求。
[0007]本专利技术首先提供一种快速检测动物布鲁氏菌病的基于重组酶等温扩增荧光法(RAA荧光法)扩增用引物对和探针，所述引物用于检测序列为SEQ ID NO:1的片段，探针检测所述引物扩增的产物；
[0008]具体的，所述的引物对包含有：
[0009]上游引物：5
’‑
TTGCGCGTAAGGATGCAAACATCAAATCGGTCGC
‑3’
[0010](SEQ ID NO：2)；
[0011]下游引物：5
’‑
ACCATCTTTCAGCCTCTCGCCTGCCGGT
‑3’
(SEQ ID NO：3)；
[0012]本专利技术还提供用于检测上述引物扩增产物的探针，所述探针的序列如下：5
’‑
TTCTTGAAGCCTACGGCCTCACGGAAGACGATATCAAGGCTGAACACC TG
‑3’
(SEQ ID NO：4)；
[0013]所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5
′
端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3
′
端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔了1个碱基A，第33位的A用四氢呋喃残基替换；
[0014]修饰后的探针为：5
’‑
TTCTTGAAGCCTACGGCCTCACGGAAGACGA/i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/CAAGGCTGAACACCTG(C3 spacer)
‑3’
。
[0015]进一步，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3。
[0016]优选地，所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ1。
[0017]上述的引物和探针用于制备RAA荧光检测试剂盒。
[0018]进一步，本专利技术还提供一种基于重组酶等温扩增荧光法快速检测动物布鲁氏菌病(牛种、羊种、猪种、犬种)的通用方法，具体步骤如下：
[0019]1)提取待检测对象的核酸样品；
[0020]2)将恒温荧光基因检测仪接通电源进行预热，对反应参数进行设置；反应参数设置为39℃，反应时间：20分钟；
[0021]3)在25μL反应缓冲液中加入13.7μL水，浓度为15μM的2.1μL上下游引物和0.6μL探针，充分混合后添加到RAA荧光基础反应试剂中混合，得到反应预混液；
[0022]4)在反应管盖上加2.5μL的Mg
2+
，将4μL所述步骤1)中得到的核酸样品与所述步骤3)中得到的反应预混液充分混合，得到的反应体系放入恒温荧光基因检测仪检测荧光信号；
[0023]5)根据RAA
‑
F1610检测仪器中的阳性判定方法，选择阈值的方法来判定曲线的阴阳性。在设置自动阈值为300，定性阈值为200，则在20分钟内，荧光值大于300的孔位会被判定为阳性，其余判定为阴性。
[0024]进一步，所述上游引物和下游引物的使用浓度为1～50μM。
[0025]优选地，所述上游引物和下游引物的使用浓度为10μM。
[0026]进一步，所述探针的浓度为1～50μM。
[0027]优选地，所述探针的浓度为10μM。
[0028]本专利技术相比于现有技术具有如下的优点：
[0029]1)本专利技术提供的引物和探针适用于基于重组酶等温扩增荧光法检测，并且能够准确、快速地检测出动物布鲁氏菌病(含牛种、羊种、猪种、犬种)，与猪链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、牛分枝杆菌无交叉反应，特异性达100％；
[0030]2)本专利技术提供的检测方法快速、容易实现高通量，同时降低了检测时间和检测成本，本专利技术提供的基于基于重组酶等温扩增荧光法快速检测动物布鲁氏菌病(牛种、羊种、猪种、犬种)的方法，灵敏度高，反应检测灵敏度在95％的概率下达到56copies/反应；
[0031]3)本专利技术提供的一种基于重组酶等温扩增荧光法快速检测动物布鲁氏菌病(牛
种、羊种、猪种、犬种)的方法，能方便快速准确地鉴定动物布鲁氏菌病(含牛种、羊种、猪种、犬种)，操作简便，检测时间短，20分钟内完成检测；无需像PCR一样，通过高温变性使DNA解旋后退火，最后再延伸，而只需在39℃下进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测动物布鲁氏菌病的扩增用引物对和探针，其特征在于，所述引物对用于检测序列为SEQ ID NO:1的片段，探针检测所述引物扩增的产物。2.如权利要求1所述的扩增用引物和探针，其特征在于，所述的引物对中的上游引物的序列为SEQ ID NO：2；上游引物的序列为SEQ ID NO：3。3.如权利要求1所述的扩增用引物和探针，其特征在于，所述的探针的序列为SEQ ID NO：4。4.如权利要求3所述的扩增用引物和探针，其特征在于，所述的探针的所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰。5.如权利要求4所述的扩增用引物和探针，其特征在于，所述的荧光报告基团修饰在探针序列离5
′
端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3
′
端碱基数16bp的位置上，且探针的第33位的A用四氢呋喃残基替换。6.如权利要求5所述的扩增用引物和探针，其特征在于，所述的述荧光报告基团为FAM；荧光淬灭基团为BHQ1。7.一种RAA荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求1
‑
6任一项所述的扩增用引物和探针。8.一种基于重组酶等温扩增荧光法快速检测动物布鲁氏...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊晓旭，孙明军，刘婷婷，田莉莉，张皓博，孙翔翔，刘蒙达，孙世雄，亓菲，焉鑫，张志，迟庆安，冯淑芳，仵国政，付树芳，魏润宇，张培培，王毓秀，邵卫星，孙淑芳，范伟兴，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：