本发明专利技术涉及一种抑制或杀灭东方黏虫的方法及其应用，具体涉及一种抑制或杀灭东方黏虫的方法和检测植物基因组是否插入Cry1B.868基因的方法。其中，所述抑制或杀灭东方黏虫的方法包括：(1)提供基因组插入编码SEQ ID NO:2所示Cry1B.868蛋白的基因的植物，所述植物表达Cry1B.868蛋白，产生东方黏虫抗性；和(2)所述植物与东方黏虫接触，抑制或杀灭所述东方黏虫。本发明专利技术发现插入该基因后，植物显示出优良的东方黏虫抗性，东方黏虫的杀虫率可达68％～76％。76％。76％。
【技术实现步骤摘要】
一种抑制或杀灭东方黏虫的方法及其应用
[0001]本专利技术涉及抗虫基因领域，具体而言，涉及一种抑制或杀灭东方黏虫的方法及其应用。
技术介绍
[0002]目前，农业生产上面临的生物胁迫(如病害和虫害等)和非生物胁迫(如旱害、寒害和盐害等)造成农作物生长势减弱，产量降低，给全球粮食安全造成巨大威胁。其中，虫害是影响农林生产力的主要生物胁迫因素之一。例如，东方黏虫(Mythinmaseparata)又名行军虫、剃枝虫，是中国重大农作物病虫之一，主要危害小麦、水稻、玉米、高粱、糜子等禾谷类作物，有报道称东方黏虫已经成为我国危害最为严重的玉米害虫。因此，开发有效针对东方黏虫的防控方法具有重要意义。
[0003]随着使用化学农药进行害虫防治造成的环境问题愈发严重，生物杀虫剂的使用逐渐进入人们的视野。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性菌，能够产生杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins，ICPs)和营养期杀虫蛋白(Vegetative insecticidal proteins，Vips)等不同类型的杀虫蛋白。其中，Cry蛋白是在芽胞形成期于芽胞内形成的一类杀虫晶体蛋白，对大多数鳞翅目害虫具有良好抗性。
[0004]在中国专利CN201980049875.1中证明Cry1B.868和Cry1Da_7基因共表达可表现出对鳞翅目害虫秋夜蛾、玉米穗蛾、西南玉米蛀虫和甘蔗蛀虫的抗性。然而，目前还未见通过Cry1B.868蛋白控制东方黏虫的相关报道。
[0005]有鉴于此，特提供本专利技术。
技术实现思路
[0006]本专利技术提供一种抑制或杀灭东方黏虫的方法和检测植物基因组DNA是否插入Cry1B.868基因的方法。
[0007]在第一方面，本专利技术提供一种抑制或杀灭东方黏虫的方法，所述方法包括：(1)提供基因组插入编码SEQ ID NO:2所示Cry1B.868蛋白的基因的植物，所述植物表达Cry1B.868蛋白，产生东方黏虫抗性；和(2)所述植物与东方黏虫接触，抑制或杀灭所述东方黏虫。
[0008]在一些具体的实施方式中，所述表达Cry1B.868蛋白的基因具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
[0009]在一些具体的实施方式中，所述植物为玉米、小麦、水稻或高粱。
[0010]在一些具体的实施方式中，所述表达Cry1B.868蛋白的基因以单拷贝插入所述植物的基因组。
[0011]在一些具体的实施方式中，所述植物的Cry1B.868蛋白表达量为3～4μg/g叶片。
[0012]在第二方面，本专利技术还提供一种检测植物基因组是否插入Cry1B.868基因的方法，取植物样本的基因组DNA进行PCR反应，根据PCR结果判断所基因组DNA是否插入Cry1B.868
基因；其中PCR反应使用具有如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列的引物对，或使用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列的引物对和SEQ ID NO:11所示的探针。
[0013]在一些具体的实施方式中，所述Cry1B.868基因表达如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0014]在一些具体的实施方式中，所述Cry1B.868基因具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
[0015]术语定义
[0016]如本文所用，术语“重组”是指通常不会在自然界中发现并由人为干预产生的非天然DNA、蛋白质或生物体。“重组DNA分子”是这样的DNA分子，其包含不会天然地一起出现并且是人为干预的结果的DNA分子的组合。例如，由至少两个彼此异源的DNA分子的组合构成的DNA分子是重组DNA分子，所述至少两个DNA分子是诸如包含转基因和与该转基因相邻的植物基因组DNA的DNA分子。
[0017]本文所指的术语“DNA”是指脱氧核糖核酸(DNA)分子。DNA分子可以是基因组或合成来源的，并且按照惯例是从5'(上游)端到3'(下游)端。如本文所用，术语“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。按照惯例，本专利技术的DNA序列及其片段根据两条互补DNA序列链中的仅一条链来公开。通过暗示和意图，此处提供的序列的互补序列(互补链的序列)在本领域中也称为反向互补序列，它们在本专利技术的范围内，并且明确地意在要求保护的主题的范围内。
[0018]本文所述的术语“PCR”，是一种需要2个位于待合成靶序列两侧的引物的体外DNA扩增方法。引物是一段寡核苷酸序列，其能够以序列特异性的方式杂交到靶序列上并在PCR过程中延伸。扩增子(Amplicons)或PCR产物或PCR片段是包括引物和新合成的靶序列拷贝的延伸产物。多重PCR系统含有多套引物，其导致同时产生多个扩增子。引物可与靶序列完全匹配或者它们可含有内部错配的碱基，该碱基可导致在特异的靶序列中导入限制性核酸酶识别/切割位点。引物也可含有额外的序列和/或修饰或标记的核苷酸以便于获取或检测扩增子。DNA的热变性、引物与其互补序列的退火和退火引物以DNA聚合酶的延伸的重复循环导致靶序列的指数扩增。术语靶或靶序列指待扩增的核酸序列。术语模板指待扩增的原始核酸。
[0019]有益效果
[0020]本专利技术发现将Cry1B.868基因插入植物(玉米)基因组DNA后，Cry1B.868转基因植物(玉米)显示出了东方黏虫抗性，并且在转基因植物(玉米)单拷贝插入Cry1B.868基因，Cry1B.868蛋白表达量在3μg/g样品时，具有优良的抗东方黏虫特性，东方黏虫的杀伤率在68％～76％左右。
附图说明
[0021]图1为本专利技术中含有Cry1B.868核苷酸序列的重组克隆载体LP19
‑
T构建流程图；
[0022]图2为本专利技术中含有Cry1B.868核苷酸序列的重组表达载体LP
‑
PT19构建流程图；
[0023]图3为本专利技术中转基因玉米植株接种东方黏虫的叶片损伤图，其中WT为野生型植株，NGM为经PCR检测为非转基因的玉米植株，Cry1B.868为转基因玉米植株。
具体实施方式
[0024]下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0025]实施例1 Cry1B.868基因的获得和合成
[0026]由南京金斯瑞生物科技公司合成Cry1B.868基因(SEQ ID NO：1)，合成的所述Cry1B.868基因的5
’
端连接有NcoI酶切位点，3
’
端连接有EcoRI酶切位点。所述Cry1B.868基因编码SEQ ID NO:2所示的Cry1B.868杀虫蛋白。
[0027]实施例2载体构建...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种抑制或杀灭东方黏虫的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)提供基因组插入编码SEQ ID NO:2所示Cry1B.868蛋白的基因的植物，所述植物表达Cry1B.868蛋白，产生东方黏虫抗性；和(2)所述植物与东方黏虫接触，抑制或杀灭所述东方黏虫。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达Cry1B.868蛋白的基因具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物为玉米、小麦、水稻或高粱。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达Cry1B.868蛋白的基因以单拷贝插入所述植物的基因组。5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述植物的Cry1B.868...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾志伟，马小伟，邸萌亮，李晓娇，王强，赵丽媛，李胜兵，孙宇，易金麒，韩雨颖，
申请(专利权)人：隆平生物技术海南有限公司，
类型：发明
国别省市：
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