用于基因疗法的双亮氨酸拉链激酶抑制剂制造技术

本公开提供了可用于治疗与双亮氨酸拉链(DLK)相关的病状，例如包括视神经病变的神经退行性病症的组合物和方法。本公开提供了调节双亮氨酸拉链激酶(DLK)或亮氨酸拉链激酶(LZK)的活性的基因构建体和载体。本公开还提供了抑制DLK的激酶和/或信号传导活性的显性负DLK(DN

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因疗法的双亮氨酸拉链激酶抑制剂
专利

[0001]本公开大体上涉及使用双亮氨酸拉链激酶的工程化抑制剂的细胞或基因疗法，包括用于神经退行性病症，诸如青光眼。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求2019年2月15日提交的美国临时专利申请号62/806,213和2019年2月15日提交的美国临时专利申请号62/806,210的优先权，其中每一个以引用的方式整体并入本文中。

技术介绍

[0004]双亮氨酸拉链激酶(DLK)是人类中由DLK基因编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶家族的成员，也称为有丝分裂原活化的蛋白质激酶12或MAP3K12。这种激酶含有亮氨酸
‑
拉链结构域，并且主要在神经元细胞中表达。显示这种激酶在突触末端中的磷酸化状态通过膜去极化经由钙调磷酸酶(calcineurin)进行调节。这种激酶形成同二聚体，以及具有含有转录因子的亮氨酸拉链的异二聚体，诸如cAMP反应性元件结合蛋白(CREB)和MYC，并且因此可在PKA或视网膜酸诱导的神经元分化中发挥调节作用。或者，已描述了编码不同蛋白质的剪接的转录变体。在激酶结果的活性位点中具有K152A点突变的DLK的表达对内源性DLK具有显性负效应。Xu等人Mol Cell Biol.21(14):4713
‑
24(2001)。
[0005]DLK已被证明是对轴突损伤的神经元反应的必要组分。DLK蛋白存在于轴突中，并且蛋白质水平响应于轴突损伤而增加(Xiong X等人J.Cell Biol,2010；191(1):211
–
223)。DLK启动了将凋亡和再生反应与轴突损伤联合的转录程序(Watkins等人,Proc Natl Acad Sci,2013；110(10):4039
‑
4044)。
[0006]视神经病变是与神经元细胞死亡，特别是称为视网膜神经节细胞(RGC)的投射神经元的死亡相关的一组视觉疾病。在视神经病变中，美国每年花费19亿美元来治疗青光眼。
[0007]因此，对于用于治疗与DLK相关的疾病或病症的组合物和方法，以及对于用于青光眼的细胞或基因疗法的组合物和方法，存在长期未满足的需求。本公开提供了此类新型组合物和方法来处理和解决这种需求。

技术实现思路

[0008]本公开提供了DLK抑制剂的各种实施方案，例如，通过与内源性DLK(称为显性负双亮氨酸拉链激酶(DN
‑
DLK))形成非活性异二聚体而以显性负方式起作用的DLK抑制剂。
[0009]在一个方面，本公开提供了可用于治疗与DLK和视网膜细胞相关的疾病或病症的组合物和方法。具体地讲，本公开提供了用于递送DN
‑
DLK的载体(包括病毒载体)、在治疗中使用此类载体的方法以及抑制细胞中的DLK活性的方法。
[0010]在一些实施方案中，本公开提供了抑制剂，其包含使用全长人DLK(SEQ ID NO:1)的编号的在位置391和393中的至少一个处具有取代的与DLK(SEQ ID NO:3)的亮氨酸拉链结构域至少95％相同的序列。
[0011]本公开还提供了重组病毒载体，包括重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包含多核苷酸序列编码本公开的抑制剂中的一种的表达盒。
[0012]本公开还提供了使用载体抑制细胞中的DLK活性的方法，以及包括本公开的一种或多种载体的药物组合物和单位剂量。本公开还提供了针对包括但不限于与视网膜细胞功能障碍相关的疾病或病症的病状的治疗方法，所述视网膜细胞功能障碍选自以下组成的组：青光眼、湿性黄斑变性、干性黄斑变性、地理性萎缩、视网膜脱离和视网膜营养不良，诸如亚瑟氏综合征(Usher
’
s syndrome)、斯塔加特氏病(Stargardt
’
s disease)、利伯氏先天性黑内障(Leber
’
s congenital amaurosis)或色素性视网膜炎。在另外其他实施方案中，所述疾病与视网膜病变相关，诸如糖尿病视网膜病变、近视性黄斑病变。在其他实施方案中，所述疾病是视神经病变，诸如视神经炎、非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NAION)、动脉炎性前部缺血性视神经病变(AION)、创伤性视神经病变、利伯氏视神经病变(Leber
’
s optic neuropathy)、显性视神经萎缩、隐性视神经萎缩或放射性视神经病变。在其他实施方案中，所述疾病可以包括肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森病(Parkinson Disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer Disease)、朊病毒相关神经退行性疾病、亨廷顿氏病(Huntington
’
s disease)、脊髓小脑性共济失调、肌肉萎缩和多系统萎缩中的一种或多种。
[0013]在另一个方面，本公开提供了包含编码双亮氨酸拉链激酶(DLK)抑制剂的多核苷酸的载体。多核苷酸可以可操作地连接至启动子。所述抑制剂能够结合(i)内源性DLK蛋白，或(ii)编码内源性DLK的内源性mRNA。在一些实施方案中，抑制剂能够降低视网膜细胞中内源性DLK的表达、信号传导活性或激酶活性。本公开还提供了治疗涉及将此类载体施用于受试者的视网膜的与视网膜细胞相关的疾病或病症的方法。可以治疗的疾病或病症包括(但不限于)与视网膜细胞功能障碍相关的疾病或病症。实例包括青光眼、视网膜病变、视网膜脱离、视神经病变和视网膜营养不良。
[0014]本公开还提供了经基因修饰的视网膜细胞，其包括已描述的多核苷酸类型，所述多核苷酸编码双亮氨酸拉链激酶(DLK)的抑制剂。本公开提供了制备此类细胞的方法，包括使其与病毒载体接触。本文还提供了药物组合物。
[0015]前述段落并非旨在定义本专利技术的每个方面，并且在其他章节，诸如具体实施方式中描述额外方面。整个文件旨在作为统一公开内容而相关，并且应理解，即使特征的组合并未在本文件的同一句子或段落或部分中一起出现，也涵盖本文中所描述的特征的所有组合。作为额外方面，本专利技术包括本专利技术的所有实施方案，其范围以任何方式比由上文特定段落定义的变化更窄。举例来说，在将本专利技术的某些方面描述为属的情况下，应理解，属的每个成员单独地是本专利技术的一个方面。
附图说明
[0016]图1A
‑
1B描绘了双亮氨酸拉链激酶(DLK)的亮氨酸拉链结构域。图1A显示了亮氨酸拉链的单个七肽重复序列(heptad repeat)的二聚化的示意图。一个单体上的七肽内的氨基酸残基由N末端至C末端方向上的字母(a)至(g)表示。其他单体上的等效位置由字母(a
’
)至(g
’
)表示。在二聚体的一个链上的e与相对链上的g
’
之间形成的对(称为e
‑
g
’
或e
’‑
g对)可以形成静电相互作用，并且在确定亮氨酸拉链二聚体的稳定性方面是重要的。图1B显示了根据同种型1编号(UniProt 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种抑制剂，其包含含有与SEQ ID NO:1共享至少95％同一性的亮氨酸拉链结构域的蛋白质，其中所述亮氨酸拉链结构域在位置391和393中的一者或多者处包含至少一个取代。2.如权利要求1所述的抑制剂，其中所述取代包含以下中的至少一者：a)K391变为D或K391变为E，和/或b)H393变为D或H393变为E。3.一种抑制剂，其包含含有与SEQ ID NO:1共享至少95％同一性的亮氨酸拉链结构域的蛋白质，所述亮氨酸拉链结构域具有至少一个取代，其中与不具有所述取代的对应蛋白质相比，所述取代单独或共同地(i)增加亮氨酸拉链结构域对内源性DLK的结合亲和力或(ii)降低所述抑制剂对自身的结合亲和力。4.如权利要求1所述的抑制剂，其中所述亮氨酸拉链结构域还包含与SEQ ID NO:1相关的选自(c)至(j)中的一个或多个的一个或多个位置处的一个或多个额外取代：a)K398,b)L407,c)H405,d)V412,e)R414,f)K453,g)L458，和h)R460。5.如权利要求4所述的抑制剂，其中相对于SEQ ID NO:1，所述一个或多个取代包含：a)如果所述一个或多个位置包含K398，则K398变为R，b)如果所述一个或多个位置包含L407，则L407变为D或L407变为E，c)如果所述一个或多个位置包含H405，则H405变为D或H405变为E，d)如果所述一个或多个位置包含V412，则V412变为D或V412变为E，e)如果所述一个或多个位置包含R414，则R414变为D或R414变为E，f)如果所述一个或多个位置包含K453，则K453变为R，g)如果所述一个或多个位置包含L458，则L458变为D或L458变为E，并且h)如果所述一个或多个位置包含R460，则R460变为D或R460变为E。6.如权利要求4所述的抑制剂，其中所述抑制性结构域在N末端至C末端的顺序上包含：a)具有序列REEVXLXFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:9)的第一多肽，b)包含20个至30个氨基酸残基、任选地SEQ ID NO:11的多肽桥，和c)具有序列YMELNALMLQLELYERELXRXEQALERR(SEQ ID NO:10)的第二多肽；其中X＝E或D并且Y＝R、H或K。7.如权利要求6所述的抑制剂，其中所述第一多肽选自由以下组成的组：a)具有序列REEVDLDFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:12)的多肽，b)具有序列REEVELDFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:13)的多肽，c)具有序列REEVDLEFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:14)的多肽，和d)具有序列REEVELEFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:15)的多肽；
其中X＝E或D并且Y＝R、H或K。8.如权利要求4所述的抑制剂，其中所述亮氨酸拉链结构域包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中的一个共享至少95％同一性的多肽。9.如权利要求5所述的抑制剂，其中所述取代(i)增加所述亮氨酸拉链结构域对内源性DLK的亲和力，或(ii)降低所述亮氨酸拉链结构域对自身的亲和力；与在所述取代位置处具有天然残基的相同亮氨酸拉链结构域相比，(i)和(ii)中的每一个。10.如权利要求9所述的抑制剂，其中与(i)所述抑制剂的同二聚体或(ii)DLK同二聚体中的任一个相比，所述亮氨酸拉链优先与内源性DLK形成异二聚体。11.如权利要求1所述的抑制剂，其中所述抑制剂还包含与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的DLK激酶结构域，其中所述DLK激酶结构域包含降低所述DLK激酶结构域的激酶活性的取代。12.如权利要求11所述的抑制剂，其中所述降低所述DLK激酶结构域的激酶活性的取代是从赖氨酸(K)变为丙氨酸(A)的相对于SEQ ID NO:1的位置152处的赖氨酸(K)的取代。13.如权利要求12所述的抑制剂，其中所述DLK激酶结构域包含SEQ ID NO:8。14.如权利要求2所述的抑制剂，其中所述抑制剂还包含LZK的功能性片段。15.如权利要求2所述的抑制剂，其中所述抑制剂还包含功能性片段神经营养因子，任选地BDNF、GDNF、NT4、TrkB、RdCVF或CNTF或其功能性片段。16.如权利要求2所述的抑制剂，其中所述抑制剂还包含能够例如通过mAKAP抑制cAMP介导的信号传导的功能性片段。17.如权利要求2所述的抑制剂，其中所述抑制剂包含第二结构域，并且其中所述第二结构域赋予神经营养活性。18.一种重组病毒载体，其包含表达盒，所述表达盒包含可操作地连接至启动子的编码如权利要求1所述的抑制剂的多核苷酸。19.如权利要求18所述的载体，其中所述病毒是重组腺相关病毒(rAAV)载体。20.如权利要求18所述的载体，其中所述表达盒侧接5
’
ITR和3
’
ITR。21.如权利要求18所述的载体，其中所述载体包含4.2kb与4.6kb之间的基因组。22.如权利要求18所述的载体，其中所述载体包含血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV2/2(7m8)或Anc80L65的衣壳。23.如权利要求18所述的载体，其中所述启动子是遍在启动子。24.如权利要求23所述的载体，其中所述遍在启动子包含CMV启动子、CAG启动子、CBA启动子或CBh启动子。25.如权利要求18所述的载体，其中所述启动子是视网膜细胞型特异性的。26.如权利要求25所述的载体，其中所述启动子是RGC特异性启动子。27.如权利要求26所述的载体，其中所述启动子是Thy1启动子、Nefh启动子或DCX启动子。28.如权利要求18所述的载体，其中所述启动子是微型启动子。29.如权利要求1所述的载体，其中所述微型启动子源自POU4F1、TUBB3、NEFL或NEFM。30.如权利要求25所述的载体，其中所述启动子是视杆细胞特异性启动子。31.如权利要求30所述的载体，其中所述启动子是视紫红质启动子或RK启动子。
32.如权利要求25所述的载体，其中所述启动子是视锥细胞特异性启动子。33.如权利要求32所述的载体，其中所述启动子是pR2.1启动子或MNTC启动子。34.一种抑制细胞中的DLK活性的方法，其包括使所述细胞与如权利要求18至33中任一项所述的载体接触。35.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞是视网膜神经节细胞(RGC)。36.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞是感光细胞。37.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞是视网膜神经元。38.如权利要求37所述的方法，其中所述细胞是视网膜神经元是双极细胞、无长突细胞或水平细胞。39.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞是多巴胺能神经元。40.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞是背侧纹状体神经元。41.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞是基底前脑胆碱能神经元。42.一种药物组合物，其包含如权利要求18至33中任一项所述的载体和药学上可接受的载体。43.如权利要求42所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含至少1e9
–
1e13载体基因组(vg)的所述载体。44.一种单位剂量，其包含如权利要求43所述的载体，其中所述单位剂量包含总体积为10
‑
200μL、优选50
‑
100μL的1e9
–
1e13 vg的载体。45.一种治疗有需要的受试者的病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求42所述的药物组合物。46.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是青光眼。47.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是视神经病变。48.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是视网膜病变。49.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是视网膜脱离。50.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是色素性视网膜炎。51.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是视网膜营养不良。52.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是黄斑变性。53.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是肌萎缩侧索硬化(ALS)。54.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是帕金森病。55.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是阿尔茨海默病。56.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是朊病毒相关神经退行性疾病。57.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是亨廷顿氏病。58.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是脊髓小脑性共济失调。59.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是肌肉萎缩。60.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是多系统萎缩。61.一种经基因修饰的视网膜细胞，其包含编码双亮氨酸拉链激酶(DLK)抑制剂的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至启动子，其中所述抑制剂能够结合(i)内源性DLK蛋白，或(ii)编码内源性DLK的内源性mRNA；以及
其中所述抑制剂能够降低所述视网膜细胞中的所述内源性DLK的表达、信号传导活性或激酶活性。62.如权利要求61所述的细胞，其中所述视网膜细胞是视网膜神经节细胞(RGC)。63.如权利要求61所述的细胞，其中所述视网膜细胞是感光细胞。64.如权利要求61所述的细胞，其中所述视网膜细胞是视网膜神经元。65.如权利要求64所述的细胞，其中所述视网膜神经元是双极细胞、无长突细胞或水平细胞。66.如权利要求61所述的细胞，其中所述启动子是遍在启动子。67.如权利要求66所述的细胞，其中所述遍在启动子包含CMV启动子、CAG启动子、CBA启动子或CBh启动子。68.如权利要求61所述的细胞，其中所述启动子是视网膜细胞型特异性的。69.如权利要求68所述的细胞，其中所述启动子是RGC特异性启动子。70.如权利要求69所述的细胞，其中所述启动子是Thy1启动子、Nefh启动子或DCX启动子。71.如权利要求69所述的细胞，其中所述启动子是微型启动子。72.如权利要求71所述的细胞，其中所述微型启动子源自POU4F1、TUBB3、NEFL或NEFM。73.如权利要求68所述的细胞，其中所述启动子是视杆细胞特异性启动子。74.如权利要求73所述的细胞，其中所述启动子是视紫红质启动子或RK启动子。75.如权利要求68所述的细胞，其中所述启动子是视锥细胞特异性启动子。76.如权利要求75所述的细胞，其中所述启动子是pR2.1启动子或MNTC启动子。77.如权利要求61所述的细胞，其中所述抑制剂是能够结合编码内源性DLK的内源性mRNA的RNA，并且其中所述抑制剂能够减少所述细胞中的所述内源性DLK的表达。78.如权利要求77所述的细胞，其中所述抑制剂是shRNA或siRNA。79.如权利要求77所述的细胞，其中所述抑制剂是微小RNA。80.如权利要求79所述的细胞，其中所述微小RNA是miR
‑
130a、miR
‑
122
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5p、miR
‑
30a
‑
5p或miR
‑
10
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3p。81.如权利要求61所述的细胞，其中所述抑制剂是能够结合内源性DLK的蛋白质...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯，
申请(专利权)人：爱科霍拉有限公司，
类型：发明
国别省市：