一种抗大田软海绵酸单链抗体的氨基酸序列及其表达载体制造技术

本发明专利技术具体涉及了一条抗大田软海绵酸的单链抗体的氨基酸序列及其表达载体。所述氨基酸序列包括：一重链可变区的氨基酸序列，其如SEQ ID No.1所示；一轻链可变区的氨基酸序列，其如SEQ ID No.2所示。编码该重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，编码该轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。所述单链抗体的核苷酸序列与带有组氨酸标签麦芽糖结合蛋白的pET28a

【技术实现步骤摘要】
一种抗大田软海绵酸单链抗体的氨基酸序列及其表达载体


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种抗大田软海绵酸单链抗体的氨基酸序列及其表达载体。

技术介绍

[0002]大田软海绵酸（Okadaic acid, OA）是一种聚醚类海洋生物毒素，其具有一定的生物毒性，由赤潮藻类产生，是一种海洋腹泻型贝类毒素。OA不具有紫外吸收，稳定性较好，对于一般加热处理方法很难将其毒性破坏。据统计，每年赤潮毒素产生的贝类毒素中毒事件累计高达300多起。2019年在对中国渤海贝类抽样检测报告中显示，23%的贝类均测出了含有OA毒素，其中毛蚶中居多，且OA已经被证实是肿瘤促进剂，严重威胁到了人类的身体健康，因此对OA毒素检测技术的开发及完善十分重要。
[0003]免疫学检测方法具有操作简便、快速、检测成本低、通量高、对技术人员的要求低的优点，适合于现场检测。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测OA，需要抗OA的抗体。以抗原免疫动物获得多抗血清是制备抗体的经典方法，但制备周期长，得到的抗体量有限。B淋巴细胞杂交瘤技术获得单克隆抗体，其特异性强，性质均一，但不易于大批量生产，特别是抗体制备中进行人为干预改进难以进行。通过基因工程技术，采用抗体分子基因重组可获得多种多样的特异性抗体，使抗体研制有了重要进展。基因工程抗体单链抗体（Singe chain variable fragment, ScFv）具有低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强、成本低、可大规模生产等特点，经由重叠延伸PCR手段拼接成完整的scFv基因，在宿主细胞中表达获得可溶性抗体。重组单链抗体（scFv）能够保留与亲本单克隆抗体（mcAb）结构相一致的高特异性抗原识别位点。与传统的单克隆抗体相比，scFv具有重要的优势，其可操作性强，可根据研究目的进行改造，结合体外表达技术，为筛选获得高灵敏性重组抗体提供了简便而高效的操作系统。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种抗大田软海绵酸单链抗体的氨基酸序列及其表达载体。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种抗大田软海绵酸单链抗体的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括：一重链可变区的氨基酸序列，其如SEQ ID No.1所示；一轻链可变区的氨基酸序列，其如SEQ ID No.2 所示。
[0006]一种编码上述的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列包括：一编码重链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID No.3所示；一编码轻链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID No.4所示。
[0007]一种含有上述核苷酸序列，且以带有可溶性组氨酸标签麦芽糖结合蛋白的pET28a
‑
MBP
‑
T7
‑6×
His表达载体为初始载体的重组质粒。
[0008]本专利技术通过基因工程技术，提取鼠源抗OA单克隆抗体杂交瘤细胞的总RNA，反转录得到cDNA后，经由PCR扩增得到重链V
H
基因和轻链V
L
基因，经过组装获得scFv基因片段，命名为OA
‑
scFv。在此基础上，将上述OA
‑
scFv基因克隆到表达载体中，进而转化至宿主E.coli感受态细胞BL21中，通过体外诱导表达获得所述抗大田软海绵酸单链抗体。其中，所述鼠源抗OA单克隆抗体杂交瘤细胞的制备方法同参考文献WangR,ZenglL,YangH,etal.Detectionofokadaicacid(OA)usingELISAandcolloidalgoldimmunoassaybasedonmonoclonalantibody.[J].JournalofHazardousMaterials,2017,339(oct.5):154
‑
160.。
[0009]所述的OA
‑
scFv抗体蛋白功能由抗体基因轻链和重链可变区的抗原决定簇互补区域CDRs中氨基酸序列决定，OA
‑
scFv抗体中6个相应的CDRs区氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域（表1）。
[0010]表1OA
‑
scFv单链抗体中轻链和重链抗原决定簇互补区域CDRs序列将所述的OA
‑
scFv基因克隆到带有组氨酸标签麦芽糖结合蛋白的pET28a
‑
MBP
‑
T7
‑6×
His表达载体中，可形成高可溶性的重组质粒。
[0011]本专利技术的显著优点在于：1.本专利技术借助于基因工程技术，从抗OA单克隆抗体杂交瘤细胞提取RNA、转化cDNA和基因PCR，直接获取与目标抗原特异识别的核心基因及其对应的氨基酸组成，结合体外表达系统即可实现抗体表达，避免了常规生物学中需要从脾脏细胞为起点进行抗体基因库构建和抗体多轮陶筛的限制，实现了不依赖动物细胞融合的OA抗体的高效制备。
[0012]2.传统单克隆抗体制备中需要采用动物免疫，由于动物免疫的限制，抗OA单克隆抗体难以大批量制备且抗体亲和力成熟难以人工干预。本专利技术通过重链V
H
基因和轻链V
L
基因提取，组装设计OA
‑
scFv的基因序列，从而实现了单链抗体的抗原决定簇互补区域CDRs信息和关键氨基酸识别位点的确定，重组单链抗体（scFv）能够保留与亲本单克隆抗体（mcAb）结构相一致的高特异性抗原识别位点；同时还可以良好地实现对抗OA抗体的基因设计和微生物体外表达，其可操作性强，从而避免了动物免疫中动物依赖和抗体亲和力成熟难的限制。
[0013]3.本专利技术将所述OA
‑
scFv基因克隆到带有组氨酸标签麦芽糖结合蛋白的载体pET28a
‑
MBP
‑
T7
‑6×
His载体中，可以提高表达蛋白的可溶性，可有效避免普通载体质粒构建后大部分形成不溶性包涵体蛋白、特异性能降低的不足的问题。
附图说明
[0014]图1为V
H
基因电泳图。泳道M为分子量标准Marker；泳道1
‑
3为PCR扩增的V
H
基因图2为V
L
基因电泳图。泳道M为分子量标准Marker；泳道1
‑
3为PCR扩增的V
L
基因图3为scFv基因电泳图。泳道M为分子量标准Marker；泳道1为PCR扩增的scFv基因。
[0015]图4为pET
‑
MBP
‑
His
‑
OA
‑
scFv表达产物的SDS
‑
PAGE分析。泳道M为分子量标准Marker；泳道1为空载体诱导表达的蛋白；泳道2为表达的总蛋白；泳道3和泳道4为pET
‑
MBP
‑
His
‑
OA
‑
scFv表达蛋白。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗大田软海绵酸单链抗体的氨基酸序列，其特征在于：所述氨基酸序列包括：一重链可变区的氨基酸序列，其如SEQ ID No.1所示；一轻链可变区的氨基酸序列，其如SEQ ID No.2 所示。2.一种编码如权利要求1所述的氨基酸序列的核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列包括：一编码重链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：林旭聪，田印琪，袁琳，谢增鸿，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：