本发明专利技术提供了一种抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区。所述的重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示，所述的轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示。本发明专利技术将携带重组抗体基因的轻链和重链真核表达质粒共转染到HEK293T细胞，进行表达纯化。用抗REGγC末端区域的单克隆抗体作为对照抗体，利用WesternBlot、细胞免疫荧光、免疫组化技术、ELISA技术对本发明专利技术抗体进行性能评价。结果显示本发明专利技术重组单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、稳定性强、不依赖动物生产、适合量化生产等优点，为以过表达REGγ蛋白作为疾病的诊断与治疗靶标提供有效的工具。治疗靶标提供有效的工具。
【技术实现步骤摘要】
一种针对抗REG
γ
全长蛋白的重组单克隆抗体及其制备方法和应用
[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种针对抗REGγ全长蛋白的重组单克隆抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
[0002]结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处，以40～50岁年龄组发病率最高，男女之比为2～3：1。发病率占胃肠道肿瘤的第3位。结肠癌主要为腺癌、黏液腺癌、未分化癌。大体形态呈息肉状、溃疡型等。结肠癌可沿肠壁环行发展，沿肠管纵径上下蔓延或向肠壁深层浸润，除经淋巴管、血流转移和局部侵犯外，还可向腹腔内种植或沿缝线、切口面扩散转移。慢性结肠炎患者、结肠息肉患者、男性肥胖者等为易感人群。根据临床诊断经验，结肠癌具有生长缓慢、疾病发展缓慢、潜伏期较长等特点。早期结肠癌患者具有5年以上的生存率高达98％，而仅有10％的末期结肠癌患者生存率超过5年，所以早期结直肠癌患者的成功诊断对于后续成功治疗有着十分重大的临床意义。
[0003]肿瘤标志物(Tumor marker)通常是指在恶性肿瘤的发生和增殖过程中由肿瘤本身所产生或是由机体对肿瘤细胞反应异常产生的，反映肿瘤存在和生长的一些物质，如蛋白质、激素、酶、RNA等。肿瘤标志物表达水平持续异常增高，再做影像学或胃肠镜检查，病理切片检查，有助于肿瘤病人的确诊。临床常见的有癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、糖类抗原(19
‑
9)、前列腺特异抗原(PSA)、鳞状细胞癌抗原(SCC)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)等，最新研究发现外泌体、循环DNA也可以作为肿瘤标志物。
[0004]REGγ，又被称为11Sγ，PA28γ，PSME3，定位于细胞核内，最初在系统性红斑狼疮病人的血清中发现被鉴定为Ki抗原。11S蛋白酶体激活因子包括REG(PA28)α,β和γ。三种蛋白在序列相似性、细胞内分布、功能等方面有所差异。REGγ通过与20S蛋白酶体的α亚基结合，使底物进入20S的催化室，接触到20S的β基，底物蛋白被降解为肽段。
[0005]近来，REGγ
‑
蛋白酶系统作为一个新的通路与人类癌症发生、发展的相关性已逐渐被关注。早前REGγ已被发现在直肠癌血清、甲状腺癌、皮肤癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌及淋巴结肿瘤中高表达，而且生物信息学研究显示REGγ表达水平与肝癌、肺癌、结肠癌分期呈正相关。最近又有研究者提出REGγ可以作为结肠癌早期诊断的血清标记物，用于筛查早期的结肠癌患者。有研究发现了REGγ基因敲除小鼠具有生长迟缓、体型偏小等生理特征，在一些细胞系中REGγ基因敲除后表现为细胞周期受阻，一些周期靶蛋白p53、p16、p21、p19也被证明是受REGγ调控的靶蛋白。此外，REGγ对免疫抑制、促进血管新生、刺激EMP代谢及EMT上皮间充质转化等代谢活动起到重要作用，这些研究证明了REGγ促进细胞增殖而抑制细胞凋亡，因而促进肿瘤细胞的恶性增殖。罗氏公司曾在2006年发表的《Identification of PSME3 as a Novel Serum Tumor Marker for Colorectal Cancer by Combining Two
‑
dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis with a Strictly Mass Spectrometry
‑
based Approach for Data Analysis》论文中通过ELISA方法检测肿瘤病人
血清中REGγ的含量，指出将REGγ蛋白作为结肠癌的血清学早期检测标志物。随着REGγ新的靶蛋白的不断发现，对肿瘤的病理发生过程及具体的调控机制也不断深入探究，REGγ可能作为癌症新的治疗靶点，可以对REGγ作为癌症预防、诊断、治疗提供有力的工具。
[0006]基因工程抗体，又叫重组抗体，从杂交瘤细胞、免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA，反转成cDNA，以编码抗体的基因为模板，利用重组DNA技术将该基因克隆到表达载体，并转到适当的宿主细胞(如酵母、细菌、哺乳动物细胞)在体外进行表达、折叠、翻译后修饰，形成有功能的抗体，超出了免疫系统的限制。这种方式生产的抗体是特定种类的抗体，包括IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。不仅可以生产全长抗体，也可以生产各种片段抗体，如scFv、Fab。
[0007]与杂交瘤细胞单抗相比，重组单抗有以下优点：成本上经济高效，适合高通量生产；生产周期短；具有高度的批次间一致性与稳定性；可以避免鼠单抗引发的人体免疫反应；不仅可以生产全长抗体，也可以生产Fab、scFv、sdAb等片段抗体，可以在多种宿主细胞中表达；可以通过抗体工程技术进行人源化、提高亲和力改造；重组抗体不需要使用动物，避免了动物伦理问题；纯化需要的抗原更少等。
[0008]针对REGγ蛋白的肿瘤相关研究，甚至到临床水平需要大量的单抗，目前还没有能够用于这方面的重组抗体，而且，目前市面上出现的REGγ抗体为兔源的多克隆抗体。与单克隆抗体相比，其特异性较差，而且容易产生背景和杂带，还存在批次不专一、稳定性差等问题。
技术实现思路
[0009]为了解决现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种针对抗REGγ全长蛋白的重组单克隆抗体及其制备方法和应用，本专利技术所述生产方法特异性强，灵敏度高，可以实现单抗的量产。
[0010]本专利技术的关键在于所使用的真核表达质粒为分泌型，抗体能够在宿主细胞HEK 293T细胞中正确折叠，形成有功能的抗体分子，与REGγC末端多肽免疫得到的单抗相比，其灵敏度高，特异性强。
[0011]本专利技术提供了一种抗人REGγ蛋白序列的重组单克隆抗体(抗人REGγ全长蛋白的重组单克隆抗体)，该重组单克隆抗体也可以识别小鼠的REGγ。所述重组单克隆抗体命名为Mc
‑
IgG
‑
REGγ
‑
R2单克隆抗体，所述重组单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区。
[0012]其中，所述重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示，或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上的序列一致性；
[0013]其中，所述轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ NO:2和SEQ ID NO:4所示，或与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上的序列一致性。
[0014]在一个优选的实施方式中，所述的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述的重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示，或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上的序列一致性；所述的轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示，或与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上的序列一致性。2.如权利要求1所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体，其特征在于，所述的重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示；和/或，所述的轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示。3.如权利要求1或2所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体，其特征在于，所述重组单克隆抗体识别的抗原决定簇位于IgG的重链和轻链可变区。4.如权利要求1或2所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体，其特征在于，所述重组单克隆抗体与REGγ抗原特异性结合，不结合其同源蛋白REGα。5.如权利要求1或2所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体，其特征在于，所述重组单克隆抗体为全长抗体。6.一种细胞系，其特征在于，高表达、稳定分泌如权利要求1或2所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体。7.如权利要求6所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系为哺乳动物细胞系。8.如权利要求6所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系为融合杂交瘤细胞，命名为Mc
‑
IgG
‑
...
【专利技术属性】
技术研发人员：李晓涛，张变红，张丽丽，童璐，李磊，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。