分离的多肽及其合成方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种分离的多肽，该多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，该多肽的第14位氨基酸和第33位氨基酸通过C

【技术实现步骤摘要】
分离的多肽及其合成方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种分离的多肽、多肽的合成方法、提高多肽功能有效性的方法、Kv1.3通道抑制剂、多肽在制备药物中的用途、药物及药物组合物。

技术介绍

[0002]自身免疫疾病是困扰全球的重大健康难题，该类疾病的发病机理不清，药物开发空间大。据估计，全球大约有5～8％的人口受到自身免疫疾病的威胁，逐年上升的致残率与死亡率亦提示自身免疫疾病的诊断与治疗正面临着巨大挑战。
[0003]近些年来，钾离子通道作为新的免疫抑制的药物靶点，越来越受人关注，成为自免疾病药物开发热点。
[0004]在免疫系统中，Kv1.3通道主要表达在T淋巴细胞上，参与调控T淋巴细胞的激活，而阻断Kv1.3通道会减少促炎症细胞因子的产生和扩散，起到抑制免疫激活的作用。钾离子通道Kv1.3作为新的免疫抑制的药物靶点备受关注的另一个重要原因在于Kv1.3的分布具有T细胞亚型的特异性。不同活化状态的免疫细胞膜上Kv1.3钾离子通道的表达水平是不同的，从而使得通道对胞内钙离子浓度增加的贡献产生差异。在自身免疫疾病中，Kv1.3的选择性抑制剂会选择性影响TEM细胞的功能。
[0005]因此制备一种高效的Kv1.3通道阻断剂以及研究一种高效简单的生产Kv1.3通道阻断剂的方法显得很有必要。

技术实现思路

[0006]为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种分离的多肽。根据本专利技术的实施例，所述多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述多肽的第14位氨基酸和第33位氨基酸通过C-S键相连和/或第8位氨基酸和第28位氨基酸通过S-S键相连和/或第18位氨基酸和第35位氨基酸通过S-S键相连。根据本专利技术实施例的多肽对Kv1.3通道靶标具有高选择性，对Kv1.3通道具有较高的抑制特性，可以快速高效地靶向Kv1.3通道并抑制其活性，进而减少促炎症细胞因子的产生和扩散，降低自身免疫反应。
[0007]GVPTDVKCRGSQPCIQPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(SEQ ID NO:1)
[0008]在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种多肽的合成方法。根据本专利技术的实施例，使具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽的至少下面两个氨基酸之间相连：第14位氨基酸和第33位氨基酸通过C-S键相连；第8位氨基酸和第28位氨基酸通过S-S键相连；第18位氨基酸和第35位氨基酸通过S-S键相连。根据本专利技术实施例的方法可以使多肽的第14位氨基酸和第33位氨基酸之间的S-S键替换为C-S键，可以使第8位氨基酸和第28位氨基酸以及第18位氨基酸和第35位氨基酸通过S-S键准确相连，并且不会发生错配。本专利技术的方法操作简单、成本低廉、适合大规模生产。
[0009]根据本专利技术的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0010]根据本专利技术的实施例，所述方法包括：(1)利用Fmoc固相合成法，根据SEQ ID NO:1
所示的序列将氨基酸由C端向N端依次偶联至树脂上，以便获得第一氨基酸序列；(2)利用替换构件对所述第一氨基酸序列的第33位氨基酸进行替换，以便形成Cys14-Cys33的C-S键；(3)利用保护基对所述第一氨基酸序列的下列两组氨基酸位点之一进行保护：第8位氨基酸和第28位氨基酸，第18位氨基酸和第35位氨基酸，以便获得第二氨基酸序列；(4)基于第二氨基酸序列，根据SEQ ID NO:1所示的序列将氨基酸由C端向N端依次偶联至树脂上，将树脂上的氨基酸之间进行缩合连接，以便获得第三氨基酸序列；(5)对所述第三氨基酸序列进行第一二硫键氧化，使未受保护基保护的氨基酸位点之间形成二硫键，以便获得第四氨基酸序列；(6)针对所述第四氨基酸序列，对所述保护基进行去除，以便获得第五氨基酸序列；(7)对所述第五氨基酸序列进行第二二硫键氧化，使去除保护基的氨基酸位点之间形成二硫键，以便获得多肽。根据本专利技术实施例的方法，游离氨基酸以树脂为固相载体，按照SEQ ID NO:1所示的序列由C端向N端依次偶联至树脂上。对于第33位的半胱氨酸，选择可以与半胱氨酸形成C-S键的替换构件将第33位的半胱氨酸替换，以便使其后续与第14位的半胱氨酸形成C-S键；对于第14位的半胱氨酸，采用四(三苯基膦)钯与苯硅烷的混合物(摩尔比1:5)作为脱除试剂脱除其Alloc和Allyl保护基团，使用PyAOP/DIEA环化缩合体系使氨基酸序列反应4h，将第33位二氨基二酸与第14位氨基酸进行缩合成环；对于第15位的氨基酸，采用含有20％哌啶的DMF溶液作为脱除试剂脱除其Fmoc保护基，以便使其与第14位的半胱氨酸相连；对于第35位和第18位或者第8位和第28位的半胱氨酸选用侧链为Mmt(对甲氧基苯基-二苯基甲基)的保护基进行选择性保护，保护其中一组，以便氨基酸序列连接完成后进行二硫键氧化时，可以使二硫键精准形成不产生错配，不会产生例如第35位与第8位或者第28位的半胱氨酸形成二硫键的情况。在所有氨基酸均偶联到树脂上之后，去除所有氨基酸上的Fmoc，以便氨基酸之间进行缩合反应，按照氨基酸序列顺序相互连接。在氨基酸序列连接完成后，进行二硫键氧化，首先将未进行保护基保护的半胱氨酸进行二硫键氧化，随后去除保护基，再进行一次二硫键氧化，此时刚刚去除保护基的半胱氨酸之间则形成二硫键，使用此种方法可以有效避免二硫键的错配。同时，本专利技术实施例的方法不需要复性，即可完成二硫键氧化，形成二硫键，减少操作步骤，操作简便，利于大规模生产。
[0011]根据本专利技术的具体实施例，本专利技术的方法包括：(1)利用Fmoc固相合成法，根据SEQ ID NO:1所示的序列将氨基酸由C端向N端依次偶联至树脂上，以便获得第38到第35位氨基酸序列；(2)利用侧链为对甲氧基苯基-二苯基甲基保护基保护所述第35位氨基酸，继续进行氨基酸连接，以便获得第38位到33位氨基酸序列；(3)利用二氨基二酸对所述第33位氨基酸进行替换，继续进行氨基酸连接，以便获得第38位到第15位氨基酸序列；(4)利用含有20％哌啶的DMF溶液脱除所述第15位氨基酸的保护基，利用四(三苯基膦)钯与苯硅烷的混合物脱除第14位氨基酸的保护基，以便获得第38位到第14位氨基酸序列；(5)对第33位到第14位氨基酸序列进行环化缩合，使第33位二氨基二酸与第14位氨基酸形成缩合环，继续进行氨基酸与树脂的偶联，将树脂上的氨基酸之间进行缩合连接，以便获得第38位到第1位氨基酸序列；(6)对所述第38位到第1位氨基酸序列进行第一二硫键氧化，使第8位氨基酸和第28位氨基酸之间形成二硫键，以便获得具有Cys8-Cys28的氨基酸序列；(7)对所述具有Cys8-Cys28的氨基酸序列进行第二二硫键氧化，使第18位氨基酸和第35位氨基酸之间形成二硫键，以便获得所述多肽化合物。
[0012]根据本专利技术的实施例，所述替换构件为二氨基二酸；优选地，所述替换构件包括如
式(1)所示的结构：
[0013]根据本专利技术的实施例，替换构件可以替换氨基酸序列中的半本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述多肽的第14位氨基酸和第33位氨基酸通过C-S键相连和/或第8位氨基酸和第28位氨基酸通过S-S键相连和/或第18位氨基酸和第35位氨基酸通过S-S键相连。2.一种多肽的合成方法，其特征在于，使具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽的至少下面两个氨基酸相连：第14位氨基酸和第33位氨基酸通过C-S键相连；第8位氨基酸和第28位氨基酸通过S-S键相连；第18位氨基酸和第35位氨基酸通过S-S键相连。3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，包括：(1)利用Fmoc固相合成法，根据SEQ ID NO:1所示的序列将氨基酸由C端向N端依次偶联至树脂上，以便获得第一氨基酸序列；(2)利用替换构件对所述第一氨基酸序列的第33位氨基酸进行替换，以便形成Cys14-Cys33的C-S键；(3)利用保护基对所述第一氨基酸序列的下列两组氨基酸位点之一进行保护：第8位氨基酸和第28位氨基酸，第18位氨基酸和第35位氨基酸，以便获得第二氨基酸序列；(4)基于第二氨基酸序列，根据SEQ ID NO:1所示的序列将氨基酸由C端向N端依次偶联至树脂上，将树脂上的氨基酸进行缩合连接，以便获得第三氨基酸序列；(5)对所述第三氨基酸序列进行第一二硫键氧化，使未受保护基保护的氨基酸位点之间形成二硫键，以便获得第四氨基酸序列；(6)针对所述第四氨基酸序列，对所述保护基进行去除，以便获得第五氨基酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：田长麟，郑勇，吕佩，
申请(专利权)人：苏州星洲生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：