用于BK病毒LAMP检测的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了基于环介导的等温扩增(LAMP)技术进行BK病毒检测的方法，用于所述方法的引物组及相应试剂盒。利用所述引物组能够特异性的环介导等温扩增BK病毒。本发明专利技术方法特异性好、灵敏度高、重复性好、操作简单、方便快捷，可良好地应用于鉴定BK病毒，适用于临床和实验室检测。实验室检测。

【技术实现步骤摘要】
用于BK病毒LAMP检测的试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物学和核酸检测
，尤其是涉及基于环介导的等温扩增BK病毒引物组、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]人BK病毒(BK virus，BKV)是基因组大约5300bp的无囊膜环状双链DNA病毒，与人JC病毒(JC virus,JCV)、猴SV40病毒同属于多瘤病毒家族(polyomaviruses)。BKV人群感染率超过85％，但有临床症状者常限于免疫功能缺陷的个体。BKV的原发感染多发生在儿童时期，随后在泌尿系统潜伏感染，BKV潜伏感染也见于淋巴组织及肝、肺、眼、脑等处。BKV是机会性病原体，免疫正常的人群无感染症状，当宿主免疫功能降低或受到抑制时BKV可重新活化并致病。器官移植术后长期服用免疫抑制剂导致患者免疫功能低下是BKV活化的主要诱因。大约6％的肾移植患者因BKV感染引发BKV相关性肾病(BKVN)，其中50
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70％的BKVN患者最终导致移植肾失去功能。BKVN已成为肾移植术后最严重的并发症及影响肾移植病人长期生存和功能的关键因素之一。BKV的感染还与造血干细胞移植患者的出血性膀胱炎，进行性多灶性脑白质病、肺部疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等相关。而目前临床上对BKVN除降低免疫抑制外无有效的抗病毒手段，而免疫抑制强度降低又容易诱发器官排斥。因此，BKV感染的早期诊断对肾移植患者预后具有重要临床意义。
[0003]BKVN诊断的金标准是肾组织活检，联合肾小管间质肾炎表现、血清肌酐升高等确诊BKVN。由于BKVN病灶的局限性导致准确取样困难，灵敏度会受到影响。并且肾组织穿刺带有创伤性，不易被病人接受。同时肾组织活检还要排除急性排斥反应，药物毒性和其他潜在疾病的影响。患者BKV激活复制后尿液首先表现为病毒尿症，可通过尿液decoy细胞镜检判断。Decoy细胞为来源于尿道上皮的脱落细胞，显微镜下可见核内病毒包涵体及细胞病变效应。但这种方法受限于尿液病理差异及尿道结构的个体差异，结果判定主观，难以做到标准化。荧光定量PCR检测血液、尿液中BKV的DNA，被认为是目前最适合用于肾移植术后监测病人发生BKVN的无创诊断方法。但由于缺乏统一检测标准，不同检测体系造成了结果差异较大，无法进行横向比较，病毒拷贝数的阈值无法达成共识，给报告解读带来一定困扰。现有用于检测BKV的方法大都检测周期长，速度慢，而且检测准确度不高，所以我们急需能够实现快速、有效且准确检测BKV的产品，以用于BKV的检测。
[0004]环介导等温扩增(LAMP)是一种在等温条件下特异性快速扩增DNA的新型技术。不同于PCR，LAMP技术使用2
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3对引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶来识别目标基因中的六个不同区域。目标序列在60
–
65℃恒温下扩增，60分钟内扩增效率高达109–
10
10
。执行LAMP检测只需要一个恒温模块，避免了PCR的热循环需求。LAMP检测技术具有高灵敏度、特异性、便利性和高效率的特征，已被广泛用于病原体诊断。
[0005]综上，开发基于环介导的等温扩增BK病毒的引物组、试剂盒及相应的检测方法在本领域具有重要意义。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于检测BKV的LAMP引物、探针及试剂盒。该引物组可特异、灵敏扩增BKV，该检测方法操作简单、快速准确、特异性好、灵敏度高。
[0007]本专利技术第一方面提供了用于检测BKV的LAMP引物组；所述检测BK病毒的环介导等温扩增方法的引物组，是由一对外引物、一对内引物和环引物组成，其中所述的外引物由F3和B3、内引物由FIP和BIP、环引物由LB组成。
[0008]在某些实施方案中，环引物为两条，LF和LB。
[0009]在某些实施方式中，所述引物组选自BK1、BK2、BK3、BK4和BK5任一组。
[0010]所述BK1引物组包括：序列如SEQ ID NO:1所示的F3，序列如SEQ ID NO:2所示的B3，序列如SEQ ID NO:3所示的FIP，序列如SEQ ID NO:4所示的BIP，序列如SEQ ID NO:5所示的LB。
[0011]所述BK2引物组包括：序列如SEQ ID NO:6所示的F3，序列如SEQ ID NO:7所示的B3，序列如SEQ ID NO:8所示的FIP，序列如SEQ ID NO:9所示的BIP，序列如SEQ ID NO:10所示的LB。
[0012]所述BK3引物组包括：序列如SEQ ID NO:11所示的F3，序列如SEQ ID NO:12所示的B3，序列如SEQ ID NO:13所示的FIP，序列如SEQ ID NO:14所示的BIP，序列如SEQ ID NO:15所示的LF，序列如SEQ ID NO:16所示的LB。
[0013]所述BK4引物组包括：序列如SEQ ID NO:17所示的F3，序列如SEQ ID NO:18所示的B3，序列如SEQ ID NO:19所示的FIP，序列如SEQ ID NO:20所示的BIP，序列如SEQ ID NO:21所示的LB。
[0014]所述BK5引物组包括：序列如SEQ ID NO:22所示的F3，序列如SEQ ID NO:23所示的B3，序列如SEQ ID NO:24所示的FIP，序列如SEQ ID NO:25所示的BIP，序列如SEQ ID NO:26所示的LB。
[0015]所述五组引物组中的环引物探针各自的5
’
端修饰有荧光淬灭基团，3
’
端修饰有荧光报告基团；所述的荧光报告基团选自6
‑
羧基荧光素、六氯
‑6‑
甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯
‑6‑
羧基荧光素、羧基
‑
X
‑
罗丹明、6
‑
羧基四甲基罗丹明、2，7
‑
二甲基
‑
4，5
‑
二氯
‑6‑
羧基荧光素、磺酰罗丹明、6
‑
羧基
‑4’
，5
‑
二氯
‑2’
，7
’‑
二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一种；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3。
[0016]本专利技术第二方面提供了第一方面所述的引物组在制备BK病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
[0017]本专利技术第三方面提供了包含第一方面所述引物组的试剂或试剂盒。
[0018]在某些实施方式中，所述试剂盒用于样品中BK病毒的检测。
[0019]在某些实施方式中，所述试剂盒除引物组外，还可以包括反应缓冲液、DNA聚合酶、无核酸酶水；所述DNA聚合酶可以为Bst DNA聚合酶。
[0020]在某些实施方式中，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。所述阳性对照为含有BK病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种BK病毒环介导等温扩增检测引物组，其特征在于，所述引物组选自BK1、BK2、BK3、BK4或BK5；所述BK1引物组包括：序列如SEQ ID NO:1所示的F3，序列如SEQ ID NO:2所示的B3，序列如SEQ ID NO:3所示的FIP，序列如SEQ ID NO:4所示的BIP，序列如SEQ ID NO:5所示的LB；或，所述BK2引物组包括：序列如SEQ ID NO:6所示的F3，序列如SEQ ID NO:7所示的B3，序列如SEQ ID NO:8所示的FIP，序列如SEQ ID NO:9所示的BIP，序列如SEQ ID NO:10所示的LB；或，所述BK3引物组包括：序列如SEQ ID NO:11所示的F3，序列如SEQ ID NO:12所示的B3，序列如SEQ ID NO:13所示的FIP，序列如SEQ ID NO:14所示的BIP，序列如SEQ ID NO:15所示的LF，序列如SEQ ID NO:16所示的LB；或，所述BK4引物组包括：序列如SEQ ID NO:17所示的F3，序列如SEQ ID NO:18所示的B3，序列如SEQ ID NO:19所示的FIP，序列如SEQ ID NO:20所示的BIP，序列如SEQ ID NO:21所示的LB；或，所述BK5引物组包括：序列如SEQ ID NO:22所示的F3，序列如SEQ ID NO:23所示的B3，序列如SEQ ID NO:24所示的FIP，序列如SEQ ID NO:25所示的BIP，序列如SEQ ID NO:26所示的LB；其中，F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物，LF、LB为环引物。2.权利要求1所述的引物组在...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱同玉，王吉妍，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：