一种病毒核酸突变检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种新型冠状病毒Delta毒株的特异检测方法及应用。该特异性检测方法，包括Cas12蛋白、特异性非天然导向RNA、DNA报告探针及反应缓冲液体系。本发明专利技术可以实现对新型冠状病毒野生型与Delta突变型病毒毒株的高效区分。分。

【技术实现步骤摘要】
一种病毒核酸突变检测方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种用于鉴定病毒突变位点或毒株的特异性非天然导向RNA、体系、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是基因变异的最常见形式，与疾病状态或药物反应密切相关。单核苷酸多态性在病毒进化及传播中发挥重要作用，并且对突变毒株单核苷酸多态性水平的精准检测对疫病防控至关重用。因此，SNP检测对于早期诊断，临床预后和疾病预防非常重要。迫切需要研究人员开发简单、快速和有效的技术，以允许在医疗现场进行灵敏和特异性的基因分型和SNP定量。
[0003]新型冠状病毒SARS
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CoV
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2的Delta(B.1.617.2)变体，于2020年底在印度被发现。Delta毒株具有高度传染性，其传染性是之前变体和原始毒株的2倍以上。Delta毒株由SARS
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CoV
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2的刺突蛋白中的19R、(G142D)、156del、157del、R158G、L452R、T478K、E484Q、P681R、D950N突变定义。其中一些突变可能会影响针对受体结合蛋白(452和478)的关键抗原区域和部分N末端结构域(156和157)缺失的免疫反应。其中，P681R突变直接改变弗林蛋白酶裂解位点邻近的氨基酸，这是病毒侵入人体细胞的关键步骤，从而增强病毒的传染性。该毒株在暴露四天后首次在感染者中检测到，而在原始毒株感染者中平均为6天，这表明Delta毒株的复制增强。感染此变体的个体的病毒载量比感染原始毒株的人的病毒载量高出1260倍。Delta变体导致全球病例的激增。
[0004]目前，有多种方法可用于单核苷酸多态性(SNP)基因分型，每种方法都有其优点和局限性。例如，基于核酸测序技术能准确鉴定SNP，但该方法耗时长且需送到专业机构完成，无法在临床一线使用；基于等位基因特异性qPCR技术，虽然可以鉴定部分多位点突变，但对单位点突变的检测准确性很低。此外，大多数现有方法或者灵敏度低或者特异性差，有效的SNP鉴别通常需要使用专门的设备，训练有素的人员以及严格的实验条件和精确的温度控制。另外，还有一些现有方法存在高耗时、高费用和高复杂性的问题，使得它们在资源受限的情况下得不到实际应用。因此，急需开发高准确性、快速、简便易用的核酸突变检测技术方案。
[0005]CRISPR
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Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是细菌中的一种适应性免疫系统，Cas12是V型CRISPR
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Cas系统的效应子，通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，CRISPR
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Cas12通过引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。Cas12识别富含胸腺嘧啶(T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链DNA(dsDNA)。当Cas12蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性。基于上述特性，科学家正在试图开发基于Cas12的快速、准确及灵敏的核酸检测方法。然而，crRNA的序列对于核酸检测以及多种核酸序列的区分的灵敏度效果影响很大。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种基于CRISPR
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Cas12a法快速精准鉴定新型冠状病毒SARS
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CoV
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2突变株的检测方法，基于CRISPR
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Cas12a法检测新型冠状病毒SARS
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CoV
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2突变株的特异性crRNA、包含所述crRNA的检测体系以及试剂盒，旨在对新型冠状病毒SARS
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CoV
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2突变株进行快速、准确的检测。
[0007]第一方面，本专利技术提供了用于检测新型冠状病毒SARS
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CoV
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2野生型和/或新型冠状病毒SARS
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CoV
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2的Delta毒株的特异性crRNA，所述特异性crRNA包括：针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第452位点及其邻近1
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10个位点设计的crRNA；和/或针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第478位点及其邻近1
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10个位点设计的crRNA；和/或针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第484位点及其邻近1
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10个位点设计的crRNA；和/或针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第681位点及其邻近1
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10个位点设计的crRNA。
[0008]在一些实施方案中，所述针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第452位点及其邻近1
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10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：1
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10中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸。优选地，所述针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第452位点及其邻近1
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10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：1
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10中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸。
[0009]优选地，所述针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第452位点及其邻近1
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10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：1
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5和SEQ ID NOs：7
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10中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸。
[0010]优选地，所述针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第452位点及其邻近1
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10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：1
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5和SEQ ID NOs：7
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10中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸。
[0011]优选地，所述针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第452位点及其邻近1
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10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：10的核苷酸序列所示的核苷酸。
[0012]在一些实施方案中，所述针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第478位点及其邻近1
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测新型冠状病毒SARS
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CoV
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2Delta毒株、或区分新型冠状病毒SARS
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CoV
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2野生型和Delta毒株的特异性crRNA，其包括针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第452位点的crRNA；和/或针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第478位点的crRNA；和/或针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第484位点的crRNA；和/或针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第681位点的crRNA；所述针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第452位点的crRNA包括：由SEQ ID NOs：1
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5和SEQ ID NOs：7
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10中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸；所述针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第478位点的crRNA包括：由SEQ ID NOs：11
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15中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸；所述针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第484位点的crRNA包括：由SEQ ID NOs：17
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24中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸；所述针对SARS
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CoV
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2毒株S基因第681位点的crRNA包括：由SEQ ID NOs：25
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26，30和32
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34中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸。2.根据权利要求1所述的特异性crRNA，其包括：由SEQ ID NOs：1
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5和SEQ ID NOs：7
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10中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸；和/或由SEQ ID NOs：11
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15中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸；和/或SEQ ID NOs：17
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24中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸；和/或由SEQ ID NOs：25
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26，30，32
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34中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸。3.根据权利要求1所述的特异性crRNA，其包括：由SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：10的核苷酸序列所示的核苷酸；和/或由SEQ ID NO：11和/或SEQ ID NO：15的核苷酸序列所示的核苷酸；和/或由SEQ ID NO：17和/或SEQ ID NO：19的核苷酸序列所示的核苷酸；和/或由SEQ ID NO：25和/或SEQ ID NO：34的核苷酸序列所示的核苷酸。4.用于RPA扩增新型冠状病毒SARS
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CoV
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2毒株与S基因特异性突变相关片段的引物，所述特异性突变选自L4...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鑫杰，杨子峰，马培翔，刘明，
申请(专利权)人：广州呼吸健康研究院，
类型：发明
国别省市：