一种利用烷烃传感器进化产烃酶生产长链烷烃的方法技术

一种利用烷烃传感器进化产烃酶生产长链烷烃的方法，涉及酶工程酶蛋白定向进化技术领域，利用烷烃诱导型传感器对产烃基因进行进化和筛选，所利用的烷烃传感器是野生型烷烃诱导型启动子的突变子，基于该传感器对产烃基因进行进化和筛选，得到进化后的产烃突变子基因，最后利用该产烃突变子基因发酵生产长链烷烃。本发明专利技术首次提出了利用烷烃诱导型传感器对产烃基因进行进化和筛选，所利用的烷烃传感器是野生型烷烃诱导型启动子的突变子，基于该传感器对产烃基因进行进化和筛选，经过四轮的进化筛选，得到进化后的产烃突变子，相较于野生型基因的产烃量，本发明专利技术进化后的产烃基因，其发酵后烷烃的产量显著提高。酵后烷烃的产量显著提高。酵后烷烃的产量显著提高。

【技术实现步骤摘要】
一种利用烷烃传感器进化产烃酶生产长链烷烃的方法


[0001]本专利技术涉及酶工程酶蛋白定向进化
，具体是涉及一种利用烷烃传感器进化产烃酶生产长链烷烃的方法。

技术介绍

[0002]烷烃，即饱和链烃(Saturated chain hydrocarbon)，是碳氢化合物中的一种饱和烃，其整体构造仅由碳和氢两种元素所构成，因此，它是最简单的一种有机化合物。烷烃广泛存在于自然界，在昆虫、鸟、哺乳动物、植物等高等真核生物中，这些由新陈代谢产生的、疏水性的烷烃分子具有抗干燥、防水、神经保护、信号传递的功能(WaruiDM,LiN,NrgaardH,etal.Detection of formate,rather than carbon monoxide,as the stoichiometric coproduct inconversion of fatty aldehydes to alkanes by a cyanobacterialaldehydedecarbonylase.Journal of the American ChemicalSociety,2011,133(10):3316
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3319)。同时，烷烃还是汽油、柴油、航空燃料等化石燃料的主要组成部分，在整个能源系统中占有至关重要的地位(Schirmer A,udeMA,LiX,etal.Microbial biosynthesis ofalkanes.Science,2010,329(5991):559
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562)。商业化的烷烃是以石油为原料通过分馏得到的。利用分馏法生产烷烃会不可避免的消耗大量石油资源，并且生产过程会对环境造成污染。目前，随着全球经济快速增长对能源需求的激增，石油等化石燃料资源不断减少，而伴随化石燃料燃烧造成的环境问题日益激增，可再生生物燃料的发展逐渐引起了人们的重视。
[0003]生物能源作为一种可再生的能源，对其进一步的研究可缓解甚至最终消除能源危机。理想的生物燃料替代品必须具备高能量密度、低吸湿性、低挥发性，并且与现存发动机设备和运输设施相兼容等性能(L.P.Wackett,Biomss to fuels via microbial transformations,Current Opinion in Chemical Biology 12(2008)187
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193)。烷烃作为汽油、柴油、航空煤油的最主要成分，是十分理想的能源替代品。烷烃在自然界中广泛存在，很多生物包括植物、藻类、真菌都能够产烃。在较早的研究中，油料农作物、林木及油藻等被作为重点研究和开发对象，但都面临高成本，低产量的问题。
[0004]目前，人们普遍认为微生物细胞中合成烷烃是依赖脂肪酸合成途径，它以脂肪酸合成途径的中间代谢产物脂肪酰
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酰基载体蛋白(Acylcarrierprotein,ACP)作为合成烷烃的直接原料。但是，细胞中脂肪酸的合成途径在转录水平和蛋白水平上都被严格地调控，故在自然条件下微生物细胞中无法实现大量积累其合成途径的中间代谢产物(Fujita Y,Matsuoka H,HirookaK.Regulation of fatty acidmetabolism in bacteria.Molecular Microbiology,2007,66(4)):829
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839)。随着合成生物学和代谢工程的发展，人们利用遗传学、酶学及代谢工程手段通过改造微生物代谢途径提高微生物脂肪烃的产量获得了许多进展(X.Tan,L.Yao,Q.Gao,et al.Photosynthesis driven conversion of carbon dioxide to fatty alcohols and hydrocarbons in cyanobacteria,Metabolic Engineering 13(2011)169
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176)。2010年，Schirmer等成功鉴定了蓝藻中脂肪烃的合成途径，并且将来源于
点形念珠藻PCC73102的npun_R1711和来源于聚球藻PCC7942的orf1594进行组合，在敲除fadE的大肠杆菌中进行表达，脂肪烃产量达到300mg/L，并且产生的脂肪烃80％是分泌到细胞外，这将有利于脂肪烃产物的提取(A.Schirmer,M.A.Rude,X.LI,E.Popova,S.B.delCardayre,Microbial biosynthesis of alkane,Science 329(2010)559
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562)。Sang Yup Le等2019年通过敲除带有酰基CoA脱氢酶和alkane
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1单加氧酶的大肠杆菌菌株，过表达脂肪酶，折叠酶，酰基CoA合成酶和异源酰基CoA还原酶，酰基ACP还原酶和醛脱甲酰加氧酶，脂肪烃的产量达到脂肪烃的产量达到了5.2g/L(Kim H M,Tong U C,Choi SY,et al.Engineering of an oleaginous bacterium for the production of fatty acids and fuels[J].Nature Chemical Biology,2019,15(7)721
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729)，是到目前为止报道的最高产烃量。
[0005]现阶段微生物烷烃产量的提高主要通过改造微生物代谢途径来实现的，这种进化方法虽然目的明确、可行性高，但是对进化设计思路要求极高并且无法对缺乏了解的目标物进行改造，使用受到了很大的限制，并且所获得的突变菌株烷烃生产效率仍无法满足现代化商业应用的要求。定向进化技术不需要准确了解待进化物的分子机制及结构功能关系，而是通过引入随机突变和重组，人为制造出原本不存在的多样性突变子，并且按照特定的需要施以选择压力，筛选出具有期望特征的突变子，实现分子水平的模拟进化，进化更具有针对性且拥有更好的应用价值.
[0006]近年来利用生物传感器检测和高通量筛选细胞内重要中间代谢产物被广泛应用。这种细胞内代谢物水平的监测对于理解代谢通量的分布非常重要，而全细胞生物传感器对关键代谢物的监测，正是检测重要代谢途径中碳流量的理想选择，进而可以指导在代谢工程中对微生物进行优化和改良。然而，由于缺乏相关代谢物的生物传感器，极大限制其应用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用烷烃传感器进化产烃酶生产长链烷烃的方法，以解决现有技术的基于野生型产烃基因所存在的产烃量低的问题。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种利用烷烃传感器进化产烃酶生产长链烷烃的方法，利用烷烃诱导型传感器对产烃基因进行进化和筛选，所利用的烷烃传感器是野生型烷烃诱导型启动子的突变子，基于该传感器对产烃基因进行进化和筛选，得到进化后的产烃突变子基因，最后利用该产烃突变子基因发酵生产长链烷烃；所述烷烃诱导型传感器为含有pUC19本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用烷烃传感器进化产烃酶生产长链烷烃的方法，其特征在于，利用烷烃诱导型传感器对产烃基因进行进化和筛选，所利用的烷烃传感器是野生型烷烃诱导型启动子的突变子，基于该传感器对产烃基因进行进化和筛选，得到进化后的产烃突变子基因，最后利用该产烃突变子基因发酵生产长链烷烃；所述烷烃诱导型传感器为含有pUC19
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ep3alks
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EGFP载体的Top10工程菌，其中ep3alks具有如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；所述进化后的产烃突变子基因含有p15A
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m4aar
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ado质粒，其中m4aar
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ado具有如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烷烃诱导型传感器的制备方法步骤如下：1)、野生型烷烃诱导型操纵子基因的获得：以质粒pCOM8
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Alks为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所述的引物做PCR扩增，获得含有烷烃结合位点ABS，启动子Palks和调节蛋白alkS基因的野生型烷烃诱导型操纵子alks；2)、野生型烷烃诱导型重组载体的构建利用EcoRI和XhoI双酶切pUC19载体和步骤1)扩增获得的野生型烷烃诱导型操纵子，T4连接酶连接，使野生型烷烃诱导型操纵子替代pUC19载体中原本的lac启动子，获得pUC19
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Alks载体；再在pUC19
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Alks载体的调节蛋白alkS基因的下游引入绿色荧光蛋白EGFP基因，获得野生型烷烃诱导型重组载体pUC19
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Alks
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EGFP，所述EGFP基因是以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为引物，以质粒pPRars
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GFP为模板克隆获得的；利用EcoRI和XhoI双酶切pUC19载体同步构建pUC19
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AID
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EGFP空白对照质粒，用无功能序列AID(activation
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induced cytidine deaminase)替换pUC19
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Alks
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EGFP质粒中的烷烃诱导型操纵子，所述AID序列是以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6为引物，以pCI
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mAID为模板克隆获得的；3)、定向进化获得烷烃诱导型生物传感器以pUC19
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Alks
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EGFPP质粒为模板，对烷烃诱导型操纵子的烷烃结合位点ABS，启动子Palks和调节蛋白alkS基因进行易错PCR，获得随机突变体文库，对随机突变体文库进行流式高通量筛选；利用EcoRI和XhoI进行双酶切，用获得的随机突变体替换pUC19
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AID
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EGFP中的AID基因，构建重组突变体文库，其中连接体系中，插入片段和载体的摩尔比为4:1，或在每100ul连接体系中加入50ng载体以及200ng片段，连接反应条件为22℃连接30min；连接产物经电转化，导入Top10感受态细胞，获得流式筛选文库，进行流式高通量筛选；所述易错PCR的引物如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；经过三轮流式高通量筛选，最终获得进化后的含有pUC19
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ep3alks
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EGFP载体的Top10工程菌，即为进化后的细菌生物传感器，其中，ep3alks具有如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，利用烷烃传感器进化产烃酶生产长链烷烃的方法步骤如下：1)、野生型产烃基因的获得：以质粒pAL112为模板，以SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈少鹏，陈东东，吴李君，李顺兰，陶诗频，徐升敏，肖翔，
申请(专利权)人：皖南医学院，
类型：发明
国别省市：