外泌体在胸主动脉夹层/动脉瘤中的作用制造技术

本发明专利技术涉及生物医学领域，特别涉及外泌体在胸主动脉夹层/动脉瘤中的作用。正常小鼠组在30天内的生存率是100％，使用BAPN药物诱导小鼠建立主动脉夹层/动脉瘤组的生存率在第三周初时开始降低，到实验周期4周时，总体生存率维持在50％，而在此基础上，注射外泌体组，我们可以看到小鼠生存率在第三周后略微降低，到实验周期4周时，生存率维持在70％。由以上数据，我们可以得出注射外泌体后，显著延缓了胸主动脉夹层/动脉瘤的发生。脉夹层/动脉瘤的发生。

【技术实现步骤摘要】
外泌体在胸主动脉夹层/动脉瘤中的作用


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，特别涉及外泌体在胸主动脉夹层/动脉瘤中的作用。

技术介绍

[0002]胸主动脉夹层/动脉瘤(TAAD)是一种侵袭性血管疾病，需要早期诊断和有效治疗。但是，由于特定的血管结构和病变部位狭窄，目前尚无有效的治疗TAAD的方法。TAAD是指主动脉壁全层发生永久性扩张，管腔直径超过正常50％形成主动脉瘤，随着血流的冲击，主动脉内壁发生损伤，高速血流通过撕裂内膜形成夹层。胸主动脉夹层/动脉瘤的年发病率约为7～9例/10万，破裂后若未及时救治，48h时内病死率高达50％～68％，3个月内可达90％，10年病死率仍为20％。目前临床上急性TAAD主要采用外科开胸手术或血管内修复治疗，但手术期病死率高，术后并发症多、复发率高。因此，针对TAAD发病机制，寻找一种可在疾病早期针对病理学改变进行精准靶向治疗的药物尤为重要。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术提供外泌体可以延缓动脉夹层/动脉瘤的发生。外泌体可以通过不开胸，以微创的方式延缓胸主动脉夹层/动脉瘤的发生，提高了存活率。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0005]本专利技术提供了外泌体在制备预防、延缓和/或治疗胸主动脉夹层/动脉瘤的药物或制剂中的应用。
[0006]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述外泌体的施用方式为内眦静脉施用，每次施用剂量100μL，每周注射3次。
[0007]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述胸主动脉夹层/动脉瘤动物模型的诱导剂包括β
‑
氨基丙腈(BAPN)。
[0008]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述胸主动脉夹层/动脉瘤动物模型的构建方法中，第一周和第二周BAPN浓度为6mg/mL，第三周和第四周BAPN浓度增大至8mg/mL。
[0009]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述外泌体的构建方法包括如下步骤：
[0010]步骤1：将处于对数生长期、生长状态良好的UMSC细胞，与胎牛血清混合后离心，去除先前存在于血清中的外泌体，使用含有10％不含外泌体胎牛血清的α
‑
MEM培养基培养48h，待细胞密度达到90％时收集培养基的上清，传代；
[0011]步骤2：取步骤1收集的所述上清，离心，除去死的细胞和碎片，收集上清；
[0012]步骤3：取步骤2收集的所述上清，与外泌体分离试剂混匀后4℃条件下抽提24h，获得抽提液；
[0013]步骤4：取步骤3获得的抽提液离心，收集沉淀，经PBS重悬，测定外泌体的浓度；将测好浓度的外泌体置于
‑
80℃超低温保存。
[0014]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤1中所述离心具体为：以110000g的速度离心7h；
[0015]步骤2中所述离心具体为：以2000g的速度离心30min；
[0016]步骤4中所述离心具体为：4℃，以13000g的速度离心1h。
[0017]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤3中所述外泌体分离试剂包括PEG4000；所述外泌体分离试剂与所述上清的体积比为1：2。
[0018]更重要的是，本专利技术还提供了预防、延缓和/或治疗胸主动脉夹层/动脉瘤的药物或制剂，包括外泌体和药学上可接受的辅料；
[0019]所述外泌体如所述构建方法制得。
[0020]具体的，所述外泌体的构建方法包括如下步骤：
[0021]步骤1：将处于对数生长期、生长状态良好的UMSC细胞，与胎牛血清混合后离心，去除先前存在于血清中的外泌体，使用含有10％不含外泌体胎牛血清的α
‑
MEM培养基培养48h，待细胞密度达到90％时收集培养基的上清，传代；
[0022]步骤2：取步骤1收集的所述上清，离心，除去死的细胞和碎片，收集上清；
[0023]步骤3：取步骤2收集的所述上清，与外泌体分离试剂混匀后4℃条件下抽提24h，获得抽提液；
[0024]步骤4：取步骤3获得的抽提液离心，收集沉淀，经PBS重悬，测定外泌体的浓度；将测好浓度的外泌体置于
‑
80℃超低温保存。
[0025]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤1中所述离心具体为：以110000g的速度离心7h；
[0026]步骤2中所述离心具体为：以2000g的速度离心30min；
[0027]步骤4中所述离心具体为：4℃，以13000g的速度离心1h。
[0028]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤3中所述外泌体分离试剂包括PEG4000；所述外泌体分离试剂与所述上清的体积比为1：2。
[0029]此外，本专利技术还提供了预防、延缓和/或治疗胸主动脉夹层/动脉瘤的药物组合，包括外泌体、任意其他有效成分和药学上可接受的辅料。
[0030]本专利技术实验结果表明：外泌体可以通过不开胸，以微创的方式延缓胸主动脉夹层/动脉瘤的发生，提高了存活率。如3B所示，我们可以看到正常小鼠组在30天内的生存率是100％，使用BAPN药物诱导小鼠建立主动脉夹层/动脉瘤组的生存率在第三周初时开始降低，到实验周期4周时，总体生存率维持在50％，而在此基础上，注射外泌体组，我们可以看到小鼠生存率在第三周后略微降低，到实验周期4周时，生存率维持在70％。由以上数据，我们可以得出注射外泌体后，显著延缓了胸主动脉夹层/动脉瘤的发生。
附图说明
[0031]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0032]图1示人脐带间充质干细胞来源外泌体的鉴定结果；其中，本专利技术使用倒置显微镜观察了外泌体来源的人脐带间充质干细胞的形态，可以看到呈长梭形的状态，如图1A所示，随后通过收集细胞培养基上清，采用差速离心法逐步去除细胞碎片等杂质，使用PEG4000和外泌体抽提试剂盒将外泌体抽提分离，将收集到的人脐带间充质干细胞来源的外泌体进行鉴定；使用扫描电子显微镜进行形态学观察，结果显示，外泌体的直径在60nm左右，为具有
典型杯状形态的圆形颗粒，如图1B所示；与此同时，纳米粒度分析仪结果显示，外泌体的直径分布在30
‑
100nm之间，如图1C所示；流式细胞术进一步检测了外泌体标志蛋白CD63的表达，如图1D所示，发现外泌体中CD63+含量高达99.9％；Western Blot检测了外泌体标志蛋白TSG101的表达，发现外泌体具有高表达TSG101的特性，如图1E所示；以上鉴定结果表明我们分离得到的人脐带间充质干细胞来源的外泌体符合检测要求，可应用于后续实验；
[0033]图例解释：Size(d.nm):尺寸(直径纳米)；Numeber(Percent):数量(百分比)；CD63:外泌体标志蛋白；Count:数量；UMSC
‑
Exo:人脐带间充质干细胞来源的外泌体；UMSC:人脐带间充质干细胞；TSG101:外本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.外泌体在制备预防、延缓和/或治疗胸主动脉夹层/动脉瘤的药物或制剂中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述外泌体的施用方式为内眦静脉施用，每次施用剂量100μL，每周注射3次。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述胸主动脉夹层/动脉瘤动物模型的诱导剂包括β
‑
氨基丙腈(BAPN)。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述胸主动脉夹层/动脉瘤动物模型的构建方法中，第一周和第二周BAPN浓度为6mg/mL，第三周和第四周BAPN浓度增大至8mg/mL。5.如如权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述外泌体的构建方法包括如下步骤：步骤1：将处于对数生长期、生长状态良好的UMSC细胞，与胎牛血清混合后离心，去除先前存在于血清中的外泌体，使用含有10％不含外泌体胎牛血清的α
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MEM培养基培养48h，待细胞密度达到90％时收集培养基的上清，传代；步骤2：取步骤1收集的所述上清，离心，除去死的细胞和碎片...

【专利技术属性】
技术研发人员：李杨欣，刘冯，沈振亚，张瑜，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：