一种ASP联合hAD-MSCs治疗POI的实验方法技术

本发明专利技术涉及一种ASP联合hAD

【技术实现步骤摘要】
一种ASP联合hAD
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MSCs治疗POI的实验方法


[0001]本专利技术涉及一种ASP联合hAD
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MSCs治疗POI的实验方法。

技术介绍

[0002]放疗(Radiotherapy RT)所致卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency POI)。RT是多种癌症的常见治疗方式，所有癌症患者中大约有70％的疾病治疗过程中接受了RT。放射线可以直接或间接作用造成机体的多器官损伤，其中，代谢旺盛、更新较快的生殖细胞最容易被射线损伤。既往研究表明，当卵巢暴露于辐射时射线通过以下几种作用损伤生殖细胞：1)卵母细胞会通过细胞死亡途径丢失；2)颗粒细胞损伤导致性腺激素产生受损；3)卵巢血管和间质受到损害。这些损伤导致POI，甚至卵巢早衰(premature ovarian failure POF)，POF是POI的终末阶段。POI是女性40岁之前出现月经稀发、闭经，并有两次或两次以上基础卵泡刺激素(follicle stimulating hormone FSH)≥25U/L，雌激素水平下降。临床上主要表现为全身各个系统并发症，如骨质疏松、心血管疾病、老年性痴呆等，并伴随生殖器官的萎缩。严重危害女性的身心健康。另外，放射线不仅损伤卵巢，子宫暴露于放射线也会导致子宫内膜、子宫肌层和血管结构的不可逆转的损害，从而进一步导致POI/POF的发生。不同报道中癌症患者经过RT后POI的发生率，文献检索发现POI的患病率从2.1％到82.2％不等。POI的发生与治疗剂量、个体年龄、放疗范围和个体卵巢储备有关，并且除盆腔以外，腹部、头颅及全身均可以导致POI，但盆腔放疗对卵巢功能的损伤最为严重，而且既往研究证实卵巢功能障碍的发生率与放疗剂量显著相关。终末期的POI即POF是不可逆的，但是早期发现并及时有效治疗可能会延迟甚至改善病情。因此，寻找一种有效而安全的保护策略对于年轻的癌症患者和医师都是至关重要的。
[0003]RT所致POI发生机制：研究发现，放射线导致组织中水分子裂解直接产生活性氧自由基,通过诱发吞噬细胞呼吸爆发等作用间接产生活性氧自由基，使组织细胞的氧化还原平衡破坏，产生氧化胁迫，直接损伤蛋白质、核酸、脂质等生物大分子，或扰乱细胞的信号传导途径，对组织细胞造成可逆或不可逆的损伤。实际上吞噬细胞行使功能的物质基础就是活性氧产物,它们不仅能对组织细胞直接作用导致机体炎症发生,还能通过局部生成的趋化因子放大炎症反应。氧自由基的产生导致毛细血管膜的通透性增强，照射后最突出的病理变化就是早期岀现渗出性水肿，其渗出液含有溶解的低纤维蛋白，它的长期存在并持续刺激成纤维细胞增生并分泌胶原蛋白，可导致纤维化形成。因此，清除活性氧自由基是降低辐射反应的有效方法之一。卵巢对辐射高度敏感，损伤机制通过电离和活性氧类的形成导致卵泡细胞凋亡、氧化应激、卵巢萎缩、皮质纤维化和血管损伤。这些变化导致炎性细胞的积累和一系列炎性因子的释放。这些炎性因子促进大量氧自由基、活性氧(ROS)产生和细胞毒性发生。这可以归因于微环境中炎性和纤维化介质的增多、表观遗传变化和正常氧代谢的破坏，导致卵泡DNA直接损伤、卵泡萎缩和卵巢储备降低，最终引起卵巢激素的产生减少而过早出现更年期。申请人在前期研究中发现，放射性损伤导致卵巢炎性因子产生增加，ROS积累，大鼠性周期及性激素紊乱，卵泡闭锁，卵巢功能受损伤。结合研究背景和前期研究
基础，申请者提出科学问题：通过拮抗放疗所致的氧化和炎性损伤，清除体内的氧自由基，是否能有效地抵抗放射线对卵巢的损害、防止POI的发生？
[0004]FOXO3a的国内外研究进展：当机体受到放射线损伤发生氧化应激时，累积的ROS通过激活多种信号通路，使FOXO3a发生磷酸化/去磷酸化翻译后修饰，从而调控FOXO3a的活性与功能。而这一过程是相当复杂，有些甚至是矛盾的。FOXO3a是重要的转录因子，能促进氧化应激、抑制代谢、从而引起细胞凋亡。FOXO3a调节其下游基因的机制取决于细胞类型及其周围环境的刺激，不同的条件对FOXO3a活性和目标选择产生深远的影响，其范围可能从触发细胞死亡到通过诱导抗氧化应激因子的表达促进存活。FOXO3a活性调节的经典机制是由PI3K/AKT途径介导的，它是PI3K/Akt信号通路的直接靶标，它的功能受到磷酸化的关键调节，磷酸化的PI3K激活AKT，被激活的AKT进而磷酸化FOXO3a，磷酸化的FOXO3a保留在细胞质中，进一步被泛素化降解，丧失正常的转录活性，细胞凋亡将会降低。研究表明：卵母细胞内FOXO3a磷酸化水平增加，可以促进原始卵泡和初级卵泡的发育；相反，当AKT途径受到抑制时，大部分去磷酸化的FOXO3a进入了细胞核并加速细胞凋亡。换过来说，AKT和它的下游分子也能被FOXO3a进行负调节，它们的表达状态能促使细胞凋亡，去磷酸化的FOXO3a既可通过调控Fas/FasL、Bim、Caspases等凋亡相关蛋白表达诱导细胞凋亡,又可通过调控细胞周期蛋白如p27
kip
、CyclinD等使细胞周期停滞在G0/G1期。证据表明，FOXO3a的调控可以促进多种细胞的凋亡，如：造血干细胞、神经元细胞、间充质干细胞等。卵母细胞核中FOXO3a的过度表达可通过上调caspase
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3和caspase
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8，促凋亡蛋白以及Bim，FasL和P27
kip1
来导致卵母细胞凋亡。干细胞DNA修复与FOXO3a凋亡通路的调控密切相关，FOXO3a可促进干细胞的增殖即有助于维持干细胞的功能，调控PI3K
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FOXO3信号通路可以促进间充质干细胞移植治疗卵巢去势模型大鼠的卵巢功能。综上所述：FOXO3a是POI的可能的治疗靶点，联合干细胞可促进卵巢功能的修复。
[0005]目前为止放疗所致POI临床上还没有确切有效的方法彻底的恢复卵巢功能。在肿瘤治疗中用于保护卵巢功能的是促性腺激素释放激素激动剂，但是存在点火效应和延误治疗的风险，效果尚不确切，而且价格昂贵，因此临床上应用受限；激素补充治疗仅能缓解症状，不能根治，而且还有严重副作用；保存成熟的卵子，胚胎和卵巢组织样本来保护生育能力，并非所有患者都是保留生育能力的候选人，而且保存的组织存在癌症转移的风险。除了保留生育力外，很多患者还需要采取其他的方法来确保具有足够的激素水平以维持全身健康。MSCs具有自我更新和多向分化潜能，可维持、修复、改善或再生受损的组织和器官的潜能，因此它为恢复POI卵巢功能及生育能力带来了希望。目前，国内外关于MSCs在放射损伤治疗中的研究已有大量文献报道，MSCs分泌大量干细胞因子可以明显改善放疗小鼠骨髓细胞凋亡，减少辐射诱导的内皮细胞基质金属蛋白酶的表达，从而使血管功能恢复正常，血管结构损伤减轻。而且MSCs移植也可以减轻放疗所致的全身炎症，促进放疗所致肺损伤、肠损伤、皮肤损伤的恢复。同时也证明在肿瘤病人自体MSCs移植的安全性。胎儿源人羊膜间充质干细胞(Human Amniotic Mesenchymal s本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ASP联合hAD
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MSCs治疗POI的实验方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1)ASP含药血清的制备：当归多糖含药当归用量按照临床用量换算成大鼠的用量，当归多糖按当归的用量同比换算成相对剂量；当归多糖组按254.2mg/kg/d腹腔注射1周，注射完后2小时处死大鼠，心脏取血，常规方法收集血清，56℃30min，灭活补体，0.22μm滤过除菌，
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20℃保存备用；2)不同浓度ASP含药血清加入培养基中培养hAD
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MSCs，探索最佳浓度ASP含药物血清浓度，并对hAD
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MSCs进行鉴定、纯化；3)hAD
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MSCs移植：采用尾静脉和卵巢局部两种移植路径，hAD
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MSCs移植方式分为一次移植，放疗后4周移植一次、两次移植放疗开始和放疗后4周各移植一次；植入PKH26标记hAD
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MSCs4
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106/0.6mlPBS；4)实验分组：a.对照组：腹腔注射与ASP组等时等量的生理盐水；b.假手术组：同hAD
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MSCs卵巢移植组，麻醉下手术切开腹部，暴露卵巢，向卵巢注射等量PBS；c.戊酸雌二醇组：给予0.3mg/kg/d腹腔注射，稀释药物生理盐水同ASP组；d.模型组：构建放疗模型，方法同前；e.ASP:放疗开始腹腔注射ASP254.2mg/kg/d，共4周；f.hAD
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MSCs组：移植PKH26标记含ASP药物血清培养hAD
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MSCs4
×
106/0.6mlPBS，经尾静脉和卵巢两种途径移植，分一次移植组和两次移植组；g.hAD
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MSCs+ASP组：腹腔注射ASP联合PKH26标记ASP含药血清培养hAD
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MSCs移植，腹腔注射ASP同e组，hAD
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MSCs移植同f组；h.hAD
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MSCs对照组+ASP组：腹腔注射ASP联合移植PKH26标记无ASP含药血清培养hAD
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MSCs，移植方法和ASP使用同g组；i.hAD
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MSCs+ASP组+LY294002阻断剂，阻断hAD
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MSCs联合ASP上调PI3K/AKT/FOXO3a磷酸化信号通路的表达，对其作用机制进行验证；5)一般情况：每天8:00
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【专利技术属性】
技术研发人员：何连利，谢红梅，张韵函，莫晓莉，张青云，祝叶，龙小琴，
申请(专利权)人：何连利，
类型：发明
国别省市：