一种Rg1联合hAD-MSCs治疗POI的实验方法技术

本发明专利技术涉及一种Rg1联合hAD

【技术实现步骤摘要】
一种Rg1联合hAD
‑
MSCs治疗POI的实验方法


[0001]本专利技术涉及一种Rg1联合hAD
‑
MSCs治疗POI的实验方法。

技术介绍

[0002]卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指青春期之后40岁以前出现非生理性、至少4个月以上闭经，并有两次或两次以上血清促卵泡激素(follicle
‑
stimulating hormone，FSH)＞40μ/L(两次检查时间间隔1个月以上)，血清雌二醇(estradiol，E2)＜73.2pmol/L
[1]，临床主要表现为(1)原发或继发不孕、(2)低雌激素症状：如潮热，多汗，注意力下降，性欲减退，性交痛，阴道干涩，并有不同程度的生殖器官及乳房萎缩等、(3)远期并发症：骨质疏松，心血管疾病，老年性痴呆等。POF的发病机制尚不明确，多数学者认为其发病机制与生殖细胞的迁移、卵原细胞的有丝分裂和减数分裂的发动并形成原始卵泡有关。这个复杂过程的任一环节一旦被扰乱就可引起原始卵泡池减少而导致POF。目前研究认为POF病因包括：(1)遗传因素:诸如患者X染色体数量以及结构出现异常；常染色体各组相关基因突变等；(2)免疫相关因素:诸如患者存在卵巢自体免疫性抗体；(3)患者的原始卵泡储备不足；(4)患者自身因素:诸如患者卵泡刺激素受体缺陷或存在高促性腺激素血症等；患者卵泡闭锁或耗竭加速；(5)半乳糖－1－磷酸盐尿苷转移酶或17α羟化酶等酶缺陷；(6)其他因素:诸如手术、放化疗以及环境毒素等。POF在40岁之前的发病率为1/100，30岁之前为1/1000，20岁之前为1/10000，其中在原发闭经者中占10％～28％，继发闭经者中占4％～18％，且发病率呈逐年上升的趋势，并有年轻化的趋势
[2]。在过去，我们对POF了解太少，近来，随着我们对POF认识的深入，许多治疗方法用于改善POF的症状和不同种类POF动物模型被建立作为辅佐研究的工具。动物模型建立成功的标准是基于血清性激素的改变，卵巢上卵泡的成熟度，卵巢的破坏程度。为了不同病因研究的需要，研究者们建立了不同的POF动物模型。其中半乳糖代谢紊乱模型因成模时间短，所需要的研究成本低，而且其主要的病理机制为氧化损伤，该模型可以模拟很多疾病的发病过程而备受研究者们的青睐。
[0003]D
‑
gal是人体所需要的营养物质，也是身体许多大分子物质生物合成需要的基本物质。人体摄入乳糖后，被肠道的乳糖酶转化为葡萄糖和半乳糖，半乳糖进一步代谢为UDP
‑
葡萄糖，该步骤涉及到三个重要的酶，1)半乳糖激酶，2)半乳糖
‑
1磷酸
‑
尿苷酰转移酶(galactose
‑1‑
phosphate uri
‑
dyltransferase GALT)，3)UDP
‑
半乳糖
‑4‑
差向异构酶。上述三种酶的缺乏导致半乳糖生物代谢的三大紊乱
[3]，其中最常见，最经典的是半乳糖血症，它是一种隐形遗传导致GALT的缺乏。在卵巢上，这三种酶的含量是很丰富的
[4]，这个发现被证实是因为观察到妇女们缺乏或低的GALT酶活性更容易患POF和早绝经
[5
‑
9]。D
‑
gal POF妇女发病的确切机制尚未被阐明，但是目前正在研究中，对其机制的研究将有助我们寻找D
‑
gal血症的个体化治疗,获得更多日常生活中摄入D
‑
gal饮食与卵巢功能异常相关的信息。
[0004]POF到目前为止还没有确切有效的方法彻底的恢复卵巢功能，卵巢早衰目前在临床上的治疗原则是缓解症状，同时降低骨质疏松、骨折、心脑血管疾病等远期并发症的发生率，解决不孕不育问题并伴随进行心理支持治疗的方法。现今主要治疗方法：(1)中医治疗：
中医对卵巢早衰的治疗主要是补肾与养血相结合，中医补肾益血疗法通过整体调节，重在调补肾阴、肾阳，使之恢复相对平衡，尚未发现不良反应。目前，中医常用的补肾益血方有“左归丸”、“右归丸”、“补肾活血方”。近期研究发现，针灸对于POF的治疗也有一定的疗效；(2)西医治疗：西医对POF的治疗主要是采用激素替代疗法，由于激素治疗带来的副作用，患者一般难以耐受长期治疗。但是对于渴望生育的患者治疗比较复杂，一般采取接收赠卵的方式使其受孕；(3)心理治疗：心理治疗可作为POF的辅助治疗；(4)其他治疗：国外文献提出了基因治疗
[10]和免疫学病因治疗，但均未见突破性进展。(5)干细胞移植：是目前国内外学者研究较多的一种新治疗方法，且已在多种疾病治疗中取得成功，也可能是一种治疗POF最有希望的方法。
[0005]目前认为发生POF的可能机制是：一、卵巢内始基卵泡形成数目减少、已形成的卵泡闭锁速度加快,使卵巢过早失去卵泡池；二是卵泡细胞膜细胞上FSHr减少或功能异常对FSH的刺激不敏感而致卵泡停止发育生长。FSH是由垂体分泌的一种糖蛋白激素,主要作用是促进颗粒细胞增殖分化,并通过与卵泡表面的FSHr结合从而发挥调节卵泡作用,张迪等
[11]用免疫组化方法对卵巢颗粒细胞上的FSHr进行半定量分析,发现POF颗粒细胞上FSHr的表达量明显低于对照组,甚至几乎没有阳性表达,而对照组颗粒细胞上则有丰富的FSHr阳性表达。由于颗粒细胞上FSHr逐渐减少,抑制了对卵泡生长的促进作用,导致卵泡发育异常,颗粒细胞提前凋亡,又进一步使FSHr的表达减少,促使POF的发生。卵巢颗粒细胞的凋亡也因此成为POF发病的始动因素。小鼠血清中与颗粒细胞上FSHr表达均是降低的,并且在低浓度范围内时,随着浓度降低,颗粒细胞上FSHr表达亦降低,从而使FSHr数目异常,使FSH不能与FSHr正常结合导致卵泡因缺乏FSHr刺激而停止发育,卵泡过早闭锁,久而久之导致发生POF。POF与AMH和FSHr也是相互影响的。POF卵巢遭到破坏,窦卵泡异常,卵泡过早闭锁和黄素化,颗粒细胞凋亡,致AMH表达下降,颗粒细胞的凋亡亦导致颗粒细胞上FSHr表达减少,因AMH由颗粒细胞分泌,颗粒细胞减少亦导致AMH降低.
[0006]AMH,也称为苗勒氏管抑制物质或抗苗勒氏管抑制因子,因在雄性胎儿的发育过程中有引起苗勒氏管退化的重要作用而得名。AMH是转化生长因子一区TGF
‑
内超家族中的一员,分子量为140KDa的二聚糖蛋白,并与抑制素、活化素、骨形态形成蛋白、生长分化因子等,共同构成TGFp超家族。在男性胎儿的发育过程中,AMH的分泌是苗勒氏管衰退的本质,因此形成正常发育的男性生殖管道。苗勒氏管在女性形成子宫、输卵管和阴道上部的原始细胞。妊娠36周的女性胎儿至绝经期妇女的血清中均可检测到AMH,原始卵泡中无表达,在窦前卵泡和小窦状卵泡(直径4mm)的颗粒细胞中高表达,在4
‑
8mm的卵泡中表达量逐渐下降,而在8mm以上的窦状卵泡中AMH表达消失,在闭锁卵泡本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Rg1联合hAD
‑
MSCs治疗POI的实验方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1)人羊膜间充质干细胞hAD
‑
MSCs的培养：hAD
‑
MSCs细胞培养于含10％胎牛血清FBS的RPMI 1640培养液中，并添加1％的青霉素
‑
链霉素，在充入5％CO2的湿润的37℃恒温细胞培养箱中培养，将细胞连续传代在第3代的细胞用于后续实验；2)流式细胞术对hAD
‑
MSCs的鉴定：对培养第3代的hAD
‑
MSCs细胞的表面标志物进行流式细胞术分析，以确定其干细胞特性，收获细胞并以250
×
g于室温离心5min，然后将细胞沉淀重悬于PBS中制备单细胞悬液，并使细胞浓度为1
×
105/ml，细胞分别与抗人CD
‑
133、抗人CD
‑
45、抗人CD
‑
73、抗人CD
‑
105和抗人CD
‑
90单抗于室温避光孵育20min，然后用PBS清洗细胞2次去除一抗，细胞随后与偶联有FITC或PE的山羊抗鼠IgG二抗于4℃避光孵育30min，最后，用1％多聚甲醛溶液固定细胞，上机流式细胞仪，使用Kaluza软件进行分析，表面标志物CD11b
‑
/CD19
‑
/CD34
‑
/CD45
‑
/HLA
‑
DP/DQ/DR
‑
/CD44+/CD73+...

【专利技术属性】
技术研发人员：何连利，刘晓云，谢红梅，牟大英，莫晓莉，张青云，祝叶，路祥会，
申请(专利权)人：何连利，
类型：发明
国别省市：