一种能够提高蒜氨酸含量的大蒜AsNAC1转录因子基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能够提高蒜氨酸含量的大蒜AsNAC1转录因子基因及其应用，所述大蒜AsNAC1转录因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。与现有技术相比，本发明专利技术发现AsNAC1转录因子基因可以提高大蒜愈伤细胞的蒜氨酸含量。本发明专利技术提出一种能够提高大蒜蒜氨酸含量的新型转录因子基因，通过转基因方法可以提高大蒜愈伤组织细胞的蒜氨酸合成能力，进而为提高大蒜品质提供有效途径。高大蒜品质提供有效途径。高大蒜品质提供有效途径。

【技术实现步骤摘要】
一种能够提高蒜氨酸含量的大蒜AsNAC1转录因子基因及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种能够提高蒜氨酸含量的大蒜AsNAC1转录因子基因及其应用。

技术介绍

[0002]大蒜(Allium sativum L.)属于百合科葱蒜属多年生草本植物，虽产生种子，但通常采用无性繁殖。大蒜除具有食用价值以外，还具有重要的药用保健功能，是一种重要的药食同源植物。现代医学研究表明，大蒜在抗菌消炎、预防和治疗心血管疾病以及糖尿病等方面具有显著的效果。此外其还具有一定的防癌和抗癌作用(张燕等，2005；Apple et al.,2010)。
[0003]蒜素(Alliicin)及其相关的含硫化合物是大蒜所特有的一类化合物，也是决定其独特气味和重要药用价值的关键物质。蒜素的主要成分为2
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丙烯基硫代亚磺酸酯，有蒜氨酸酶催化蒜氨酸而来。正常情况下，蒜氨酸酶存在于细胞液泡中，而蒜氨酸存在于细胞质中，当大蒜组织或细胞遭受破坏时，蒜氨酸酶从液泡中释放出来，催化蒜氨酸生成包括蒜素在内的多种含硫化合物(Shimon et al.,2005)。蒜素极其不稳定，在不同条件下会氧化生成不同的物质，不利储存和实际应用。然而其前体物质蒜氨酸则相对稳定。蒜氨酸，全称为S
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烯丙基
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L
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半胱氨酸亚砜(S
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allyl
‑
L
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cysteinesulfoxide,SACS)(Fillmore et al.,1995)，属于非蛋白类氨基酸。它是一种极易溶于水，不溶于乙醚等非极性有机溶剂的极性有机硫化物，分子量为177.22，等电点PI为4.86，它通常与多糖结合，以稳定的形式存在于大蒜鳞茎细胞中；且是大蒜中主要的硫代半胱氨酸亚砜化合物，含量约占90％(黄雪松等，2004)；具有抗炎、杀菌、抗肿瘤、抗糖尿病、保肝等作用(孙明江,2009；Anwar and Younus,2017)。虽然目前已经实现蒜氨酸的化学合成，但是产量较低，价格昂贵。此外由于蒜氨酸合成途径复杂，涉及的酶类众多，且合成关键酶还未知。所以目前还无法实现在微生物或生物反应器中生物合成蒜氨酸，其主要获取途径还是来源于新鲜大蒜组织。
[0004]NAC转录因子是植物所特有的一类转录因子家族，最早在拟南芥和矮牵牛中发现(Aida et al.,1997)。这类蛋白家族在其N端含有一个有约150个氨基酸组成的NAC结构域。该结构域可以分为5个亚区域A、B、C、D和E。其中A、C和D亚结构域高度保守，B和E亚结构域保守性相对较弱。转录调控区域则通常位于该类蛋白的C端，其氨基酸组成和功能方面呈现高度多样化(Olsen.,2005)。越来越多的研究结果表明，NAC转录因子家族在植物的生长发育、激素调控、生物及非生物胁迫等方面发挥重要的调控作用。而目前大蒜的NAC类转录因子的克隆，及其功能研究还比较少。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种能够提高蒜氨酸含量的大蒜AsNAC1转录因子基因及其应用。
[0006]技术方案：为了达到上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0007]一种能够提高蒜氨酸含量的大蒜AsNAC1转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]所述大蒜AsNAC1转录因子基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]含有权利要求1所述大蒜AsNAC1转录因子基因的植物双元表达载体。
[0010]所述大蒜AsNAC1转录因子基因提高大蒜中蒜氨酸含量的应用。
[0011]优选的，所述大蒜选自邳州紫皮大蒜。
[0012]一种获取能够高表达蒜氨酸大蒜的方法，包括将克隆有所述大蒜AsNAC1转录因子基因的植物双元表达载体，转化进入大蒜愈伤组织细胞中。
[0013]优选的，所述植物双元表达载体pHB
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AsNAC1
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GFP。
[0014]一种克隆所述大蒜AsNAC1转录因子基因的PCR引物对，引物序列如下所示：
[0015]AsNAC1
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F：ATCACCAGTCTCTCTCTCAAGCTTATGAGTTACTTGAGTATGATGGAGGC(SEQ ID NO.3)；
[0016]AsNAC1
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R：CTCGCCCTTGCTCACCATAAGCTTCCACATATTTGACCCACCATTTT(SEQ ID NO.4)。
[0017]本专利技术通过基于前期大蒜叶片夹伤实验转录组测序结果分析，鉴定到一个AsNAC1转录因子基因，该基因在大蒜叶片夹伤后基因表达水平显著上调。暗示其在大蒜抗逆胁迫过程中可能发挥作用。基于转录组测序AsNAC1转录因子基因序列信息，设计特异性引物，以夹伤后大蒜叶片组织获得的cDNA为模板，通过PCR方法，成功克隆到AsNAC1转录因子基因。以克隆到的AsNAC1转录因子基因构建植物双元表达载体，转化邳州紫皮大蒜愈伤细胞。通过荧光显微镜，以AsNAC1转录因子基因C端融合的GFP蛋白标签。观察目标基因是否成功转化并表达于大蒜愈伤细胞。收集转化有空载体和过表达AsNAC1转录因子基因的大蒜愈伤细胞，分析其蒜氨酸含量。发现过表达AsNAC1转录因子基因的大蒜愈伤细胞的蒜氨酸含量是对照的3倍。
[0018]有益效果：与现有技术相比，本专利技术发现AsNAC1转录因子基因可以提高大蒜愈伤细胞的蒜氨酸含量。本专利技术提出一种能够提高大蒜蒜氨酸含量的新型转录因子基因，通过转基因方法可以提高大蒜愈伤组织细胞的蒜氨酸合成能力，进而为提高大蒜品质提供有效途径。
附图说明
[0019]图1为AsNAC1基因的进化树分析。
[0020]图2为AsNAC1基因在夹伤胁迫条件下随时间变化的表达情况分析(以大蒜β
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actin基因为定量PCR内参基因)。
[0021]图3为pHB
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AsNAC1
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GFP图谱(仅显示基因克隆附近序列信息)。
[0022]图4为AsNAC1
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GFP过表达愈伤组织细胞荧光显微镜检测结果。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。下述实施例中的实验方式，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的实验材料和试剂，如无特殊说明，均为自
常规生化试剂供应商处购买。
[0024]实施例1大蒜抗逆相关转录因子AsNAC1基因的生物信息学分析
[0025]项目组前期研究中，以邳州大白蒜为试材，采用二代高通量测序RNA
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seq方法进行大蒜叶片夹伤胁迫应答转录组分析，发现一个差异表达基因表达蛋白具有NAC特征，位于大蒜8号染色体，将该基因命名为AsNAC1。利用相关数据库及生物信息学软件对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能够提高蒜氨酸含量的大蒜AsNAC1转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述大蒜AsNAC1转录因子基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.含有权利要求1所述大蒜AsNAC1转录因子基因的植物双元表达载体。4.权利要求1所述大蒜AsNAC1转录因子基因提高大蒜中蒜氨酸含量的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述大蒜选自邳州紫皮大蒜。6.一种获取能够高表达蒜氨酸大蒜的方法，其特征在于，包括将克隆有权利要求1所述大蒜AsNAC1转录因子基因的植物双元表达载体，转化进入大蒜愈伤组织细胞中。7.根据权利要求6所述的获取能够...

【专利技术属性】
技术研发人员：宛雯，杨绪勤，张春媚，齐东东，徐春燕，李杰，吴家莹，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：