上游调控因子IbERF10及其在调控紫心甘薯IbbHLH2表达中的应用制造技术

本发明专利技术公开了上游调控因子IbERF10及其在调控紫心甘薯IbbHLH2表达中的应用。本发明专利技术以紫心甘薯品系“A5”为实验材料，克隆了IbbHLH2的启动子序列，通过酵母单杂交文库筛选实验，成功获得了IbbHLH2基因的上游调控因子IbERF10。运用酵母单杂交回转实验和双荧光素酶报告系统检测证实，IbbHLH2启动子与上游调控因子IbERF10之间存在相互作用。亚细胞定位结果显示，IbERF10定位在细胞核。自激活活性实验结果表明，IbERF10具有自激活活性。本发明专利技术在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论，同时还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。线索。线索。

【技术实现步骤摘要】
上游调控因子IbERF10及其在调控紫心甘薯IbbHLH2表达中的应用


[0001]本专利技术涉及植物基因育种
，具体涉及上游调控因子IbERF10及其在调控紫心甘薯IbbHLH2表达中的应用。

技术介绍

[0002]bHLH类转录因子具有保守的碱性
‑
螺旋
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环
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螺旋结构域，是真核生物中广泛存在的一个较大的转录因子家族。典型的bHLH结构域在其N端包含约18个亲水性的碱性氨基酸，其后是两个由环隔开的亲水和亲脂性α螺旋。bHLH转录因子通过HLH区域形成同二聚体或异二聚体并与靶基因启动子的不同部位相结合，从而对基因的转录发挥调控作用。bHLH转录因子参与植物生长发育、信号转导和次生代谢等诸多生物学过程。其中调节类黄酮和花色素苷合成是植物bHLH转录因子最重要的功能之一。
[0003]在玉米中，影响花色素苷合成的调节基因leaf colour基因和colorless基因，起着调控结构基因表达的作用。研究发现，Lc基因对DFR、F3'5'H、ANS、UF3GT的激活作用较强，对花色素苷合成途径起到重要影响。继玉米Lc基因被克隆以后，在其它植物中先后发现了编码bHLH蛋白的基因，例如调控金鱼草花冠颜色的DELILA基因，调控矮牵牛花色JAF13和AN1基因，以及调控拟南芥种皮颜色和长角果原花色素苷合成的TT8基因等，这些调节基因均调控花色素苷合成途径下游的关键酶基因的表达。在血橙中，CsMYC2蛋白能够上调叶中UFGT的表达，从而使叶的颜色加深。在旋花科植物圆叶牵牛中，转录调控基因IpIVS(IpbHLH2)能够调控花色素苷合成途径中相关结构基因的表达，对DFR
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B和ANS的调控作用最为明显，在bHLH2表达缺陷型的植株种皮中，DFR
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B和ANS的表达量几乎为零。
[0004]在紫心甘薯中克隆获得了转录因子IbbHLH2的基因序列，IbbHLH2基因能够调控花色素苷合成途径中关键酶基因的表达，进而影响紫心甘薯中花色素苷的积累。进一步研究表明不同甘薯品种(系)及其根发育时期中，IbbHLH2基因的表达与花色素苷的合成积累是完全同步的，说明IbbHLH2是紫心甘薯花色素苷合成代谢中的关键转录调控因子。由于植物花色素苷的分子量较小，其化学结构的解析相对容易，同时不同的代谢产物可呈现不同的颜色，因此植物花色素苷合成的调控机制和信号传递过程已成为研究植物基因表达与调控以及基因与环境相互作用的理想系统。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题在于筛选一种促进紫心甘薯IbbHLH2转录因子表达的上游调控因子。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术首先用Trizol法从甘薯块根提取RNA，用SMART技术逆转录合成双链的cDNA，构建紫心甘薯酵母单杂交cDNA文库。
[0007]进一步的，以紫心甘薯块根DNA为模板，用TaKaRa高保真酶Max DNAPolymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的IbbHLH2的启动子DNA片段，并将启动子
IbbHLH2构建到pAbAi载体中，扩增IbbHLH2的启动子DNA片段的PCR引物对的具体序列如下所示：
[0008]PIbbHLH2
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F：5'
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GCATAACTTATAATCTTAAGTATGATGATCATAT
‑
3'和
[0009]PIbbHLH2
‑
R：5'
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CTACCTAAGAATTTCTAGTAGAGGTAAATTGTA
‑
3'。
[0010]构建的pAbAi
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PIbbHLH2诱饵载体经过自激活检测后，确定其自激活AbA最低抑制浓度为700ng/mL。
[0011]本专利技术其次将诱饵菌株制成Y1HGold感受态细胞，把文库质粒转入pAbAi
‑
PIbbHLH2诱感受态细胞中，通过酵母单杂交筛库对结合蛋白进行筛选，筛选得到了紫心甘薯IbbHLH2基因表达的上游调控因子为IbERF10。
[0012]因此，本专利技术的第一个目的是提供一种紫心甘薯IbbHLH2转录因子的上游调控因子IbERF10，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]本专利技术的第二个目的是提供一种上述的上游调控因子IbERF10的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014]本专利技术的第三个目的是提供一种含有上述的编码基因的重组载体或重组菌。
[0015]本专利技术的第四个目的是提供一种含有上述的编码基因的转基因细胞系或表达盒。
[0016]本专利技术的第五个目的是提供一种上述的上游调控因子IbERF10的扩增引物，该扩增引物的具体序列如下所示：
[0017]IbERF10
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F：5'
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ATGGCTCCCAAGGAGAAGGG
‑
3'和
[0018]IbERF10
‑
R：5'
‑
TTAGAGAGCGCCGGTTCCG
‑
3'。
[0019]本专利技术的第六个目的是提供上述的上游调控因子IbERF10在促进紫心甘薯IbbHLH2转录因子表达中的应用。
[0020]本专利技术的第七个目的是提供上述的上游调控因子IbERF10在促进植物花色素苷生物合成中的应用。
[0021]本专利技术的第八个目的是提供上述的上游调控因子IbERF10在植物高花色素苷品种选育中的应用。
[0022]进一步的，所述的植物为紫心甘薯。
[0023]进一步的，为了进一步验证筛选出来的上游调控因子IbERF10与启动子IbbHLH2结合，将IbERF10构建到pGADT7酵母重组表达载体，将pGADT7
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IbERF10酵母重组表达载体质粒与pAbAi
‑
PIbbHLH2诱饵载体共同转化Y1HGold酵母中进行酵母单杂交实验，结果发现：阳性对照p53AbAi+AD53转化的菌株在SD/
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Leu/AbA培养基上能够生长，而阴性对照pAbAi
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PIbbHLH2+pGADT7空载转化的菌株不能在SD/
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Leu/AbA培养基上生长。说明该酵母单杂交实验能够有效检测蛋白是否结合在启动子上。而pAbAi
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PIbbHLH2+pGADT7
‑
IbERF10在SD/
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Leu/AbA培养基上能够生长(图1)，说明IbERF10蛋白能结合在启动子IbbHLH2上。
[0024]本专利技术再次检测了上游调控因子IbERF10是否具有自激活活性，构建pGBKT7
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IbERF10融合表达载体，构建成功后将融合表达载体转入酵母Y2HGold，将转化后的菌液均匀涂布在色氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种紫心甘薯IbbHLH2转录因子的上游调控因子IbERF10，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述的紫心甘薯IbbHLH2转录因子的上游调控因子IbERF10的基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体或重组菌。5.含有权利要求2或3所述的编码基因的转基因细胞系或表达盒。6.一种权利要求1所述的紫心甘薯IbbHLH2转录因子的上游调控因子IbERF10的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物为IbERF10
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F：5'

【专利技术属性】
技术研发人员：付丹文，齐永文，陈兴龙，高峰，
申请(专利权)人：广东省科学院南繁种业研究所，
类型：发明
国别省市：