基于固态纳米孔技术对脂多糖定性或菌种来源鉴定的方法技术

本发明专利技术涉及分子检测技术领域，具体涉及一种基于固态纳米孔技术鉴定脂多糖的方法以及利用所述的方法判定脂多糖菌种来源及同菌种不同亚型的方法。所述脂多糖的鉴定方法为：在外加电压下测试待测样本在固态纳米孔中的过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值比对所述待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测。本发明专利技术创造性地将固态纳米孔应用于脂多糖检测，并联用化学共价修饰策略，能有效抑制脂多糖检测过程的非特异性吸附，所述方法操作简便、成本低、灵敏度高、准确性好，能够通过分析脂多糖穿过纳米孔的特征数据判定脂多糖的对应菌种来源及同菌种不同亚型。型。型。

【技术实现步骤摘要】
基于固态纳米孔技术对脂多糖定性或菌种来源鉴定的方法


[0001]本专利技术涉及分子检测
，具体涉及一种基于固态纳米孔技术鉴定脂多糖的方法以及利用所述的方法判定脂多糖菌种来源及同菌种不同亚型的方法。

技术介绍

[0002]脂多糖(LPS)又名内毒素，是大多数革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分。细菌内毒素广泛存在于环境中，在食品领域及很多医疗行业中用到的器械、生产过程中的原辅料、产品等都有着不同程度的污染。当细菌病原微生物入侵机体时可引起机体发热、微循环障碍、内毒素休克、播散性血管内凝血乃至全身炎症反应综合症，是脓毒症的主要诱发因子之一。
[0003]鉴于细菌内毒素毒性，脂多糖检测对确保产品质量、保障使用安全具有重要的参考价值。而不同细菌菌种来源的内毒素生物活性相差很大，因此，实现不同菌种的LPS区分有重要临床生物学意义。
[0004]传统病原体检测技术如微生物技术、生化或血清学方法等，获得的结果只能定性且准确性不高，且操作繁琐、成本高，不能精确鉴别所检测的菌株种类。而大多商用测试基于特定标记物(如内毒素)的免疫化学检测，或脂多糖血清型测定、荧光分析、标记细胞，需要高浓度样品，价格昂贵。另外，这些方法仅限于实验室测试，需要专业技术操作员，限制了它们的普遍应用。单分子纳米孔检测技术是一种检测灵敏度高、可实现快速检测、对检测样品特异性十分明显的检测技术。该技术在DNA、RNA以及蛋白质分子的结构、序列和相互作用等的检测中已经占据了重要位置。目前尚无纳米孔检测脂多糖的技术相关的专利申请。
[0005]本专利技术建立了一种全新的脂多糖鉴定方法，创造性地将固态纳米孔应用于脂多糖鉴定，可实现对待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测，并通过脂多糖穿过纳米孔的特征数据分析来精确判定所检测的细菌种类和同菌种不同亚型。同时通过外加电压的极性能判别穿孔脂多糖分子的荷电状态，也是除了物理尺寸外，对脂多糖分子在溶液中自组装构象态电荷分布差异的鉴别方式。另外，通过调节检测缓冲体系中不同双亲分子与LPS的结合情况，能提高对单分子LPS结构鉴别的准确度。本专利技术技术方案具有快速、灵敏、精准的技术优势。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术目的之一在于提供一种鉴定脂多糖的方法，该方法具高灵敏度和高精确性，为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0007]基于固态纳米孔技术鉴定脂多糖的方法，其特征在于：在外加电压下测试待测样本在固态纳米孔中的过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值比对所述待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测。
[0008]优选的，所述待测样本中的脂多糖含量可以低至μg/mL级的。比如，在实施例中，我们采用的样本为10μg/mL。
[0009]优选的，在外加电压下测试待测样本在固态纳米孔中的过孔时间和/或过孔电流
幅值和/或过孔电流相对幅值比对所述待测样本中的脂多糖的菌种来源和/或同菌种不同亚型进行判定。
[0010]优选的，所述固态纳米孔用带末端羧基的硅烷分子进行修饰，所述纳米孔的载体材料为硅基氮化硅薄膜。
[0011]优选的，所述固态纳米孔的直径为3
‑
4nm。
[0012]优选的，在外加电压下测试脂多糖在固态纳米孔中的过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值比，并作为对应菌种来源和/或同菌种不同亚型的脂多糖的特征数据。
[0013]优选的，在外加电压下测试脂多糖的电荷分布对待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测。
[0014]优选的，在外加电压下测试缓冲体系中脂多糖与不同双亲分子的结合情况对待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测。
[0015]优选的，所述纳米孔用硅烷试剂进行化学修饰，所述修饰为在通氮气条件下，将活化处理后的纳米孔置于硅烷试剂的酸性水溶液中轻微震荡反应制得孔壁带硅烷分子的固态纳米孔。
[0016]优选的，所述活化处理方式为用体积比为H2SO4:H2O2＝3:1的食人鱼洗液浸泡。
[0017]优选的，食人鱼洗液的浸泡温度为80℃，浸泡时间为0.5
‑
1h。
[0018]优选的，所述硅烷试剂酸性水溶液由等体积的硅烷试剂与乙酸加入到去离子水中稀释100倍制得。
[0019]优选的，纳米孔与硅烷试剂酸性水溶液在室温条件下反应1
‑
2h。
[0020]优选的，所述纳米孔用电介质击穿薄膜的方式制备得到。
[0021]优选的，所述的介电击穿薄膜的具体方法为：将纳米孔载体材料经食人鱼洗液80度，0.5
‑
1小时去污活化处理后再于溶液(V
H2O
：V
乙醇
＝1:1)浸泡，安置于测试池Flowcell中，对其施加电流脉冲，以介电击穿薄膜的方式，制备纳米孔孔道。
[0022]优选的，用体积比为去离子水：乙醇＝1:1溶液的浸泡中30min。
[0023]优选的，所使用的的击穿电压在13V以内，电导液为1M KCl,10mM Tris,1mM EDTA(pH 8)。
[0024]优选的，所述纳米孔载体材料为硅基氮化硅薄膜。
[0025]优选的，硅基氮化硅薄膜的膜厚为15nm，窗口大小为10μm2。
[0026]优选的，所述纳米孔直径为3
‑
4nm。
[0027]本专利技术目的之二在于提供一种可以鉴定脂多糖菌种来源的方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0028]用前述方法来判定脂多糖菌种来源和/或同菌种不同亚型的方法，具体包括以下步骤：
[0029](1)纳米孔制备：去除纳米载体材料表面的杂质后用食人鱼洗液浸泡，经清洗后用介电质击穿薄膜的方式制备纳米孔；
[0030](2)硅烷分子的固定：在通氮气条件下，将步骤(1)所得纳米孔置于酸性硅烷试剂水溶液进行轻微震荡反应制得固定有硅烷分子的固态纳米孔；
[0031](3)在外加电压下测试待测样本在固态纳米孔中的过孔时间和/或过孔电流幅值
和/或过孔电流相对幅值比对所述待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测。
[0032]优选的，步骤(1)中去除纳米孔载体材料表面的杂质的步骤为：用去离子水浸泡去除表面的无机杂质；用体积比为乙醇：异丙醇：去离子水＝1:1:1的混合溶剂浸泡去除表面的有机杂质。
[0033]优选的，步骤(2)中所述酸性硅烷试剂水溶液由等体积的硅烷试剂与乙酸加入到去离子水中反应制得。
[0034]优选的，纳米孔与硅烷试剂水溶液在室温条件下反应1
‑
2h。
[0035]优选的，步骤(3)中在外加电压50mV下测试不同菌种来源的待测样本。
[0036]优选的，步骤(3)中待测样本的脂多糖的浓度为1
‑
10μg/mL的LPS。
[0037]优选的，步骤(3)过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值储存于数据库中作为标准本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于固态纳米孔技术鉴定脂多糖的方法，其特征在于：在外加电压下测试待测样本在固态纳米孔中的过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值比对所述待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在外加电压下测试待测样本在固态纳米孔中的过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值比对所述待测样本中的脂多糖的菌种来源和/或同菌种不同亚型进行判定。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固态纳米孔用硅烷分子进行修饰，所述纳米孔的载体材料为硅基氮化硅薄膜。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固态纳米孔的直径为3
‑
4nm。5.用权利要求1
‑
4任一所述的方法来判定脂多糖菌种来源和/或同菌种不同亚型的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)纳米孔制备：去除纳米孔载体材料表面的杂质后用食人鱼洗液浸泡，经清洗后用介电质击穿薄膜的方式制备纳米孔；(2)硅烷分子的固定：在通氮气条件下，将步骤(1)所得纳...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁丽媛，朱锐，王德强，郑新川，王忠，吴吉，殷博华，尹雅洁，翁婷，田荣，
申请(专利权)人：中国科学院重庆绿色智能技术研究院，
类型：发明
国别省市：