一种糖苷水解酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种糖苷水解酶及其应用。该糖苷水解酶C25GH19B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1的第28

【技术实现步骤摘要】
一种糖苷水解酶及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种糖苷水解酶及其应用。

技术介绍

[0002]丁香假单胞菌、菜豆萎蔫病菌、茄科雷尔氏菌等植物病原细菌是造成全球范围内农作物感染的主要病原细菌，蔓延在世界各大主要作物生产区，已经造成了巨大的经济损失，因而，这些植物病原菌的防治成为国内外该领域的研究热点之一。
[0003]粘细菌是具有捕食能力的“高等原核生物”，本课题组前期分离到一株能够捕食植物病原细菌的粘细菌Corallococcus sp.c25j21，其基因组中含有两个GH19家族糖苷水解酶基因。我们对其中一个酶基因进行克隆、表达、纯化及酶学表征，发现该酶可以水解植物病原细菌来源的肽聚糖，并且对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性植物病原细菌具有很好的裂解作用，表明该酶在植物病原细菌的生物防治方面具有很好的应用潜力和研究价值。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在提供一种粘细菌来源的新型糖苷水解酶C25GH19B及其应用。
[0005]本专利技术所述的新型糖苷水解酶C25GH19B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1的第28
‑
205位氨基酸序列所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2的第82
‑
615位碱基序列所示。
[0006]具体的，所述糖苷水解酶C25GH19B来自于粘细菌Corallococcus sp.c25j21。包括205个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(具体为MPGSGVLLGGAALVGLGAWAMRGGAAAAPLTVDQLCAVMPRLTPSVAASYLGPLLAAMREAEVTTVARVAAFLAQLAHESGELRYWEELATGDAYEGRKDLGNTQPGDGRRYKGRGPIQLTGRANYRAAGAALGLPLEDKPELAALPAHGFRVAGWYWQSRHLNALADVADFVGVTRAINGGTNGLDNRVMYFDRAQRVLKTEAA)，N端27个氨基酸为信号肽，成熟的C25GH19B的理论分子量为19kDa。
[0007]进一步的，本专利技术所述的糖苷水解酶C25GH19B还涵盖在：所使用的蛋白为表现出糖苷水解酶活性的C25GH19B的突变体，包括对该蛋白少量氨基酸的修改、插入或删除。
[0008]本专利技术还公开了一种包含上述糖苷水解酶C25GH19B的编码基因的重组载体，优选，所述的重组载体为pET28a
‑
c25gh19b。
[0009]本专利技术还公开了一种包含上述重组载体的重组工程菌，优选，所述的重组工程菌的宿主菌为大肠杆菌，优选，所述的重组工程菌为大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/c25gh19b。
[0010]本专利技术所述的糖苷水解酶C25GH19B是由重组大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/c25gh19b发酵培养诱导表达、纯化回收获得。
[0011]本专利技术还提供糖苷水解酶C25GH19B在革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌肽聚糖降解中的应用。
[0012]本专利技术还提供糖苷水解酶C25GH19B在革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌裂解中的应用。
[0013]所述的病原菌为植物性病原菌，具体为植物性病原细菌，包括丁香假单胞菌、菜豆
萎蔫病菌或茄科雷尔氏菌。
[0014]本专利技术具备的有益效果：
[0015]本专利技术所述的新型糖苷水解酶C25GH19B是肽聚糖水解酶，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌来源的肽聚糖均有很好的降解活力，对菜豆萎蔫病菌、丁香假单胞杆菌、茄科雷尔氏菌等革兰氏阳性和革兰氏阴性植物病原细菌均有很好的裂解作用。
附图说明
[0016]图1为纯化后C25GH19B蛋白的SDS
‑
PAGE分析，其中，M，分子量marker；1，纯化的C25GH19B。
[0017]图2为C25GH19B对丁香假单胞杆菌、菜豆萎蔫病菌、茄科雷尔氏菌来源的肽聚糖的降解活力，其中，白色为阴性对照组，灰色为C25GH19B处理组，P.syringae为丁香假单胞杆菌，C.flaccumfaciens为菜豆萎蔫病菌，R.solanacearum为茄科雷尔氏菌。
[0018]图3为平板透明圈实验检测C25GH19B对丁香假单胞杆菌、菜豆萎蔫病菌、茄科雷尔氏菌的裂解活力，其中，A为丁香假单胞杆菌阴性对照组，B为丁香假单胞杆菌C25GH19B处理组，C为菜豆萎蔫病菌阴性对照组，D为菜豆萎蔫病菌C25GH19B处理组，E为茄科雷尔氏菌阴性对照组，F为茄科雷尔氏菌C25GH19B处理组。
[0019]图4为菌落计数检测C25GH19B对丁香假单胞杆菌、菜豆萎蔫病菌、茄科雷尔氏菌的裂解活力，其中，A为丁香假单胞杆菌阴性对照组，B为丁香假单胞杆菌C25GH19B处理组，C为菜豆萎蔫病菌阴性对照组，D为菜豆萎蔫病菌C25GH19B处理组，E为茄科雷尔氏菌阴性对照组，F为茄科雷尔氏菌C25GH19B处理组。
[0020]图5为透射电镜观察C25GH19B对丁香假单胞杆菌、菜豆萎蔫病菌、茄科雷尔氏菌的裂解作用，其中，A为丁香假单胞杆菌阴性对照组，B为丁香假单胞杆菌C25GH19B处理组，C为菜豆萎蔫病菌阴性对照组，D为菜豆萎蔫病菌C25GH19B处理组，E为茄科雷尔氏菌阴性对照组，F为茄科雷尔氏菌C25GH19B处理组。
具体实施方式
[0021]下面是本专利技术具体的实施示例。需要指出的是，这些实施例仅仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。在本专利技术的思路和范围下对实施方案的细节和形式进行的修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。
[0022]除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0023]实施例1：重组载体pET28a
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c25gh19b的构建
[0024]首先根据糖苷水解酶C25GH19B原始核苷酸序列(SEQ ID NO.2的第82
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615位)，以大肠杆菌表达宿主进行密码子优化，由金唯智公司合成经优化后的糖苷水解酶C25GH19B的编码基因，优化后的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。将优化后的编码基因克隆至pET28a载体的NcoI和XhoI位点之间，得到重组载体pET28a
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c25gh19b，将重组载体pET28a
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c25gh19b转化至克隆宿主E.coli DH5，对得到的转化子测序验证是否为正确的基因克隆(与核苷酸序列SEQ ID NO.3相同)，挑选测序正确的菌株，并提取重组质粒pET28a
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c25gh19b。
[0025]实施例2：大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)/c25gh19b的构建
[0026]从E.coli DH5提取质粒pET28本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种糖苷水解酶C25GH19B，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1的第28
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205位氨基酸序列所示。2.一种编码权利要求1所述的糖苷水解酶C25GH19B的基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2的第82
‑
615位碱基序列所示。4.一种含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体。5.一种含有权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱红惠，周晓丽，李月秋，张鲜姣，徐志强，
申请(专利权)人：广东省科学院微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：