一种分离多组同分异构体并检测29种类固醇激素的方法技术

本发明专利技术提出了一种分离多组同分异构体并检测29种类固醇激素的方法，通过对超高效液相色谱的流动相和洗脱条件进行优化，使多组同分异构体得以分离，通过优化液相条件和质谱参数可以同时检测含量跨度在ng级至pg级的不同类固醇激素，实现了对样品中包含多组同分异构体在内的29种类固醇激素含量的同步检测。在内的29种类固醇激素含量的同步检测。在内的29种类固醇激素含量的同步检测。

【技术实现步骤摘要】
一种分离多组同分异构体并检测29种类固醇激素的方法


[0001]本专利技术涉及类固醇激素检测
，具体涉及一种分离多组同分异构体并检测29种类固醇激素的方法。

技术介绍

[0002]类固醇激素主要包括肾上腺皮质激素和性激素。其中肾上腺皮质激素包括盐皮质激素和糖皮质激素，性激素包括孕激素、雄激素和雌激素。
[0003]类固醇激素是由胆固醇经一系列酶催化得到，其在结构上都是环戊烷多氢菲衍生物，结构相似物多，甚至有同分异构体存在（如17
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羟孕酮与11
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脱氧皮质酮，11
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脱氧皮质醇、21
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脱氧皮质醇与皮质酮，睾酮与表睾酮、雄酮与表雄酮等），且在人体内激素含量范围分布广ng
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pg级，雌激素和醛固酮等含量极低，在pg级。目前免疫学方法检测小分子代谢物的检测范围窄，很难达到pg级水平，抗原抗体结合易受结构类似物干扰，出现交叉反应，同时用免疫学方法对单一项目逐个检测，耗时长。类固醇激素涉及下丘脑
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垂体
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肾上腺轴和下丘脑
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垂体
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性腺轴两大代谢轴，对于肾上腺皮质增生症、肾上皮质功能减退、继发性高血压（原发性醛固酮增多症、库欣综合征等）、多囊卵巢综合征、性发育异常、性功能减退、肥胖、矮小症等相关疾病的筛查意义非凡。
[0004]液相色谱串联质谱技术利用液相色谱的高效分离能力和质谱方法的高灵敏度检测能力，可以实现类固醇激素的特异性分离和高灵敏度检测。目前已有采用液相色谱串联质谱法检测类固醇激素的报道，例如：专利CN107064400A公开了一种同时检测血清中五种类固醇激素的方法，所述五种类固醇激素分别为睾酮、雄烯二酮、11
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脱氧皮质醇、皮质醇和可的松。专利CN104807921A公开了高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的方法，所述的10种类固醇激素分别为：脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、皮质酮、孕酮、孕烯醇酮、17α
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羟孕酮和17
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羟孕烯醇酮。
[0005]上述方法虽然实现了多种类固醇激素的分离和检测，但是，所分离和检测的类固醇激素不能完整的包含整个类固醇激素代谢路径的主要激素，同时对于存在同分异构体的激素并未涉及相互测定和识别。而整个类固醇激素代谢路径至少包括29种类固醇激素，即：孕激素（孕烯醇酮、孕酮、17
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羟孕烯醇酮、17
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羟孕酮）、盐皮质激素（11
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脱氧皮质酮、皮质酮、18
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羟皮质酮、醛固酮）、糖皮质激素（11
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脱氧皮质醇、21
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脱氧皮质醇、皮质醇、18
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羟皮质醇、18
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氧皮质醇、可的松）、雄激素（脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮、双氢睾酮、11
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羟雄烯二酮、11
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酮雄烯二酮、11
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羟睾酮、11
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酮睾酮、表睾酮、雄酮、表雄酮）、雌激素（雌酮、雌二醇、雌三醇）。这29种类固醇激素在人体内含量低，含量跨度范围大，从ng级到pg级均有分布，而且结构相似物多，甚至有同分异构体存在（例如11
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脱氧皮质酮与17
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羟孕酮和11
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脱氧皮质醇、21
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脱氧皮质醇与皮质酮、睾酮与表睾酮、雄酮与表雄酮）。因此，实现对包括整个类固醇激素代谢路径的29种类固醇激素进行同时检测的难度极大。

技术实现思路

[0006]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种分离多组同分异构体并检测29种类固醇激素的方法。
[0007]本专利技术通过对检测条件的优化，从而实现同时对包含整个类固醇激素代谢路径的29种类固醇激素的高灵敏度和高特异性检测。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种分离多组同分异构体并检测29种类固醇激素的方法，包括以下步骤：通过超高效液相色谱对样品中类固醇激素进行色谱分离，所述样品包括血清、血浆、唾液、乳汁、羊水、干血片或有机溶剂样本经前处理后的样本中的任一种；通过串联质谱仪对样品中类固醇激素的含量进行检测；检测条件包括：液相条件和质谱条件，其中：液相条件包括：C8色谱柱，流动相由水相和有机相组成，水相为氟化铵水溶液，有机相为纯甲醇，采用梯度洗脱；质谱条件包括：离子源温度300
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600℃，去溶剂气600
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1100L/Hr，采用多反应监测模式进行检测。
[0009]进一步的，所述梯度系统的程序为：0
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0.5分钟，水相为60%；第4分钟，水相减至45%；第7.5分钟，水相减至25%；第8.2分钟，水相减至10%；第8.3分钟，水相为2%，第9
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10分钟，水相为60%。
[0010]液相方法是为了实现类固醇激素的高特异性分离和高灵敏度检测，流动相及洗脱程序的选择直接影响液相色谱的分离效果，本专利技术在试验过程中对多个流动相体系进行了试验，如水相中添加氟化铵、甲酸铵、乙酸铵以及建立缓冲盐体系，结果发现，只有甲醇
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氟化铵水溶液体系能将待测物峰形调至最优，并且能够将29项指标的整体待测物和内标的响应整体调到最优，从而实现同步检测。同时，为了使包含4组同分异构体的29种类固醇激素能够得到较好的分离，本专利技术采用梯度洗脱，并对洗脱程序进行多次优化，最终得到上述最优的梯度洗脱程序，在该洗脱程序下能够在最短的时间内将包含4组同分异构体的29种类固醇激素实现高特异性分离。
[0011]进一步的，所述液相条件还包括：色谱柱柱温为40
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50℃，进样器温度为5
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15℃。
[0012]进一步的，所述多反应监测模式的参数条件如下：
本专利技术的有益效果：（1）本专利技术采用液相色谱串联质谱检测方法，利用液相色谱的高效分离能力和质谱方法的高灵敏度检测能力，可以实现类固醇激素的特异性分离和高灵敏度检测，可一次检测多种化合物。
[0013]（2）与其他检测方法相比，本专利技术采用超高效液相色谱技术实现4组同分异构体
（11
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脱氧皮质酮与17
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羟孕酮和11
‑
脱氧皮质醇、21
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脱氧皮质醇与皮质酮、睾酮与表睾酮、雄酮与表雄酮）的有效分离，10分钟即可同时检测含有4组同分异构体的29种类固醇激素，且该方法中流动相用量少，可以减少成本，减少环境污染。
[0014]（3）本专利技术通过对液相色谱条件和质谱条件关键参数的优化可实现对29种不同含量（ng
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pg级）的类固醇激素的同时检测。
[0015]（4）本专利技术通过对样本的全面的方法学验证，线性、准确度、精密度均满足要求，可用于下丘脑
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离多组同分异构体并检测29种类固醇激素的方法，其特征在于，所述29种类固醇激素分别为：孕烯醇酮、孕酮、17
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羟孕烯醇酮、17
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羟孕酮、11
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脱氧皮质酮、皮质酮、18
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羟皮质酮、醛固酮、11
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脱氧皮质醇、21
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脱氧皮质醇、皮质醇、18
‑
羟皮质醇、18
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氧皮质醇、可的松、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮、双氢睾酮、11
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羟雄烯二酮、11
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酮雄烯二酮、11
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羟睾酮、11
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酮睾酮、表睾酮、雄酮、表雄酮、雌酮、雌二醇、雌三醇；具体包括以下步骤：（1）通过超高效液相色谱对样品中类固醇激素进行色谱分离；（2）通过串联质谱仪对样品中类固醇激素的含量进行检测；检测条件包括：液相条件和质谱条件，其中：液相条件包括：C8色谱柱，流动相由水相和有机相组成，水相为氟化铵水溶液，其浓度为0.2mM
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0.6mM，有机相为纯甲醇，采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0
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0.5分钟，水相为60%；第4分钟，水相...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔许净，胡滨，陈宝荣，樊晓敏，姚珺，孙慧颖，侯生根，彭宝生，
申请(专利权)人：北京金域医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：