一种前列腺癌分子靶向系统及其构建方法和应用技术方案

本发明专利技术公开了一种前列腺癌分子靶向系统及其构建方法和应用。其包括靶向外泌体以及其负载的活性成分，靶向外泌体为能特异性识别PSMA靶标的靶向外泌体，活性成分为能够抑制前列腺增殖、扩增、迁移和/或侵袭的成分；或为降低其激素抵抗性的成分。本发明专利技术构建了一种能够特异性靶向前列腺癌的外泌体，并在其上加载了能够针对影响前列腺癌激素抵抗进程的siRNA，阻断并扭转前列腺癌从激素依赖向非依赖发展的谱系过程，使肿瘤能重获雄激素的敏感性、延长激素治疗有效时间。长激素治疗有效时间。

【技术实现步骤摘要】
一种前列腺癌分子靶向系统及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种前列腺癌分子靶向系统及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]前列腺癌是男性生殖系统常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率近年来逐年提高，并渐趋年轻化。前列腺癌目前病因未明，最大特点是其有雄激素依赖性。对于早期局限性前列腺癌，常规手术或抗雄治疗疗效确切，但是晚期不可避免发展成激素非依赖甚至去势抵抗型前列腺癌(CRPC)。CRPC是前列腺癌的最终结局和治疗的重点及难点，迫切寻找新的有效治疗方法来解决耐药的问题。
[0003]最近研究提示谱系可塑性是造成CRPC耐药的关键。文献报道，表观遗传分子EZH2在前列腺癌激素依赖向非依赖转变过程中起重要作用，是影响其谱系可塑性的关键分子，直接关系到CRPC的耐药抵抗。众所周知，前列腺癌激素依赖的特点和雄激素受体(AR)密切相关，而抑制EZH2可以恢复AR表达和机体对抗雄治疗的敏感性。用药物来高效抑制EZH2这一特殊的功能，有可能成为治疗和扭转CRPC耐药的一种有效新策略。
[0004]而目前临床可供选择的EZH2小分子抑制剂虽然效果得到证实，却都不具有选择性或选择性低，影响其效果的发挥，迫切需要寻找更精准的治疗药物。RNAi作为肿瘤治疗新技术前景广阔，虽然可以进行精准治疗，确存在效应分子靶向性差、转运效率低和靶点选择等瓶颈。外泌体是细胞分泌的天然小囊泡，是细胞间通讯的重要媒介，能携带和在细胞间传递多种物质。研究证明它能够将药物或小分子核酸从供体细胞转移到受体细胞，从而引发后者表型的改变，利用外泌体来向体内递送siRNA能提高RNA输送效率并且比其他人工载体更加低毒副作用和低免疫反应，但是需要解决靶向性不足的缺点。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种前列腺癌分子靶向系统及其构建方法和应用，本专利技术构建了一种能够特异性靶向前列腺癌的外泌体，并在其上加载了能够针对影响前列腺癌激素抵抗进程的siRNA，阻断并扭转前列腺癌从激素依赖向非依赖发展的谱系过程，使肿瘤能重获雄激素的敏感性、延长激素治疗有效时间。
[0006]为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007]一种前列腺癌分子靶向系统，包括靶向外泌体以及其负载的活性成分。
[0008]进一步地，靶向外泌体为能特异性识别PSMA靶标的靶向外泌体。
[0009]进一步地，靶向外泌体的构建过程为：
[0010]将PSMA单链抗体与外泌体膜上的蛋白Lamp2b融合，构建得到PSMA
‑
Lamp2b质粒，然后慢病毒包装后感染细胞，使之分泌产生能特异性识别PSMA靶标的的靶向外泌体。
[0011]进一步地，活性成分为能够抑制前列腺增殖、扩增、迁移和/或侵袭的成分；或为降低其激素抵抗性的成分。
[0012]进一步地，活性成分为siRNA，其核苷酸序列如下：
[0013]5’‑
AAGAGGTTCAGACGAGCTGAT
‑3’
(SEQ ID NO.1)
[0014]或5
’‑
AAGACTCTG AATGCAGTTGCT
‑3’
(SEQ ID NO.2)所示。
[0015]一种上述前列腺癌分子靶向治疗系统的构建方法，包括以下步骤：
[0016](1)构建能特异性识别前列腺癌中靶基因的靶向外泌体；
[0017](2)设计具有抗肿瘤效果的siRNA，然后将其加载至靶向外泌体上即可。
[0018]上述前列腺癌分子靶向系统，或构建方法在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
[0019]进一步地，前列腺癌为去势抵抗型前列腺癌。
[0020]一种用于治疗前列腺癌的联合药物，包括上述前列腺癌分子靶向系统，以及抗雄激素药物。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022]1、本专利技术利用外泌体的天然优势，将PSMA人源化单抗和外泌体结合，构建能靶向特定PSMA阳性CRPC细胞的靶向外泌体，携带针对功能基因的siRNA，提高siRNA对前列腺癌关键靶基因的精准抑制性并对降低机体的毒副作用，为外泌体作为递送载体在前列腺癌临床的应用进行新方向的探索。直接改造外泌体使之具有CRPC靶向性是创新之处，目前国内外少见报道。
[0023]2、利用外泌体靶向输送siRNA的策略，通过靶向外泌体输送针对靶基因siRNA，在表观遗传学层面改变CRPC的谱系可塑性，扭转或是推迟前列腺癌激素抵抗的进程，增加延长其对常规ADT疗法的敏感性，从而力图改善目前CRPC最致命的耐药问题，增强抗癌效果。在CRPC表观遗传谱系塑性扭转方面的研究目前还少见报道。本方法探讨了前列腺癌表观遗传治疗新的策略和方法，特别是对去势抵抗性前列腺癌的治疗提供新的思路和方向，有望成为常规疗法的一个有力的补充。
具体实施方式
[0024]下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。
[0025]实施例1构建靶向外泌体
[0026](1)从人类天然scFv库中筛选最合适的PSMA人源化单抗，经验证后该PSMA人源化单抗有效。将经证实有效的PSMA人源化单链抗体与外泌体的质膜表面蛋白Lamp2b用基因工程的方法进行融合，构建PMSA
‑
ScFv
‑
Lamp2b质粒：合成引物分别克隆Lamp2b信号肽段(160bp)与Lamp2b成熟肽段(1160bp)，然后把PSMA
‑
ScFv(800bp)用PCR的方式插入两段序列中间，构成PSMA
‑
ScFv
‑
Lamp2b质粒。
[0027](2)体外培养前列腺上皮细胞ATCC，基质细胞WPMY
‑
1，以及巨噬细胞系RAW264.7，U
‑
93用于外泌体的产生。
[0028](3)将构建的PMSA
‑
ScFv
‑
Lamp2b质粒送吉凯公司进行慢病毒包装，然后转染作用于上述细胞，使重组载体在细胞内产生丰富PMSA
‑
ScFv
‑
Lamp2b融合蛋白。更换无外泌体血清继续培养，于48h
‑
72h后收集上清依次通过10um、5um和1um的聚碳酸质膜，收集PMSA
‑
ScFv
‑
Lamp2b靶向外泌体。
[0029](4)利用exodisc技术富集外泌体，提高产量并消除非外泌体囊泡及复合物。
[0030](5)WesternBlotting检测亲本细胞和外泌体上PMSA
‑
ScFv本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种前列腺癌分子靶向系统，其特征在于，包括靶向外泌体以及其负载的活性成分。2.根据权利要求1所述的前列腺癌分子靶向系统，其特征在于，所述靶向外泌体为能特异性识别PSMA靶标的靶向外泌体。3.根据权利要求2所述的前列腺癌分子靶向系统，其特征在于，所述靶向外泌体的构建过程为：将PSMA单链抗体与外泌体膜上的蛋白Lamp2b融合，构建得到PSMA
‑
Lamp2b质粒，然后慢病毒包装后感染细胞，使之分泌产生能特异性识别PSMA靶标的的靶向外泌体。4.根据权利要求1或2所述的前列腺癌分子靶向系统，其特征在于，所述活性成分为能够抑制前列腺增殖、扩增、迁移和/或侵袭的成分；或为降低其激素抵抗性的成分。5.根据权利要求4所述的前列腺癌...

【专利技术属性】
技术研发人员：张翔，刘家云，郝晓柯，史圣甲，王丽娟，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：