一种利用混合抗体捕获法筛选VHH/scFv的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用混合抗体捕获法筛选VHH/scFv的方法，包括以下步骤：首先，优化混合抗体的捕获条件，其次，在最优的捕获条件下，将一定比例混合的多种抗体共价偶联到芯片上，通过混合抗体同时捕获带有相应标签的VHH/scFv，最后，将抗原作为分析物进行SPR检测。本发明专利技术提供的筛选方法能够稳定捕获VHH/scFv，操作上无需对VHH/scFv进行纯化或IgG构建，节省了时间和成本，并且可以防止遗漏表达较差但亲和力较好的样品，有助于抗体研发阶段大量VHH/scFv样品的动力学结合检测和筛选。scFv样品的动力学结合检测和筛选。scFv样品的动力学结合检测和筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种利用混合抗体捕获法筛选VHH/scFv的方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种利用混合抗体捕获法筛选VHH/scFv的方法。

技术介绍

[0002]表面等离子共振技术，英文简写SPR，通过光学系统检测SPR角的变化，来间接检测吸附于金属表面的物质的质量变化，再通过进一步的拟合计算，最终可以得到两个分子结合的动力学参数，从而检测生物传感芯片上配位体与分析物之间的相互作用情况，目前，SPR已被用于研究多种生物分子间的相互作用，包括受体、抗体、抗原、酶、生长因子、糖蛋白、核酸、小分子药物、膜、细胞和病毒，由于无需标记、实时检测、样品量少、灵敏度高、方便快捷等优点，以Biacore为代表的SPR技术被广泛应用于基础科研、药物研发、生产质检等多个领域，近年来，由于越来越多的需求指向了解早期分子的动力学结合特征，Biacore检测被开始更多的用于抗体药物研发的早期筛选阶段。
[0003]VHH，纳米抗体，天然存在于骆驼体内，能够通过一个单独的重链可变区结构域识别抗原，相较于完整的IgG抗体，VHH在微生物中表达良好，并具有很高的稳定性和溶解性；scFv，单链抗体，由重链和轻链的可变区组成，这些可变区通过一段柔性肽连接在一起，和VHH相似，scFv也可以在微生物中表达良好，因此可以通过蛋白质工程改善scFv的特性，例如增加亲和力和改变特异性等。VHH/scFv形式的抗体也多出现于抗体研发的筛选阶段。
[0004]目前VHH/scFv形式的抗体进行SPR筛选，主要有三种方式：一种是通过捕获分子捕获VHH/scFv的单一标签进行SPR检测，捕获分子与VHH/scFv的表观解离速率常数通常难以达到理想值，从而对VHH/scFv和抗原的解离速率常数的检测范围产生限制。因此，另外两种方法都并非直接捕获VHH/scFv，其中一种方法是将抗原共价偶联或者捕获到芯片上，然后将纯化的VHH/scFv作为分析物，进行SPR检测；另一种方法是将VHH/scFv进行IgG构建后，通过捕获Fc来捕获IgG构建后VHH/scFv，然后将抗原作为分析物进行检测。后面两种方法，无论选择哪一种，都需要额外的步骤，比如纯化或者IgG构建，不仅产生额外的时间和费用，也导致了这些方法的通量很难达到大量筛选的要求，并且这些筛选方法还容易遗漏在微生物中表达较差但亲和力好的样品。
[0005]因此，需要开发一种基于SPR技术的，能够稳定捕获VHH/scFv的用于筛选的新方法，提高检测通量的同时扩大检测范围，降低高亲和力样品的遗漏率，为抗体研发筛选阶段降低时间和成本。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种利用混合抗体捕获法筛选VHH/scFv的方法，技术方案如下：
[0007]一种利用混合抗体捕获法筛选VHH/scFv的方法，包括以下步骤：
[0008]1)优化捕获条件：
[0009]先将单独的抗Myc标签抗体和单独的抗His标签抗体以不同比例混合，获得混合抗体，对芯片进行活化后，再使用所述混合抗体包被于所述芯片上，使用缓冲液将VHH稀释至不同浓度，使VHH流经所述芯片，并与包被在芯片上的抗体发生特异性结合，进行SPR检测并分析计算包被抗体与VHH的表观解离速率常数即表观k
d
；
[0010]比较混合比例不同的抗体和不同浓度VHH的表观解离速率常数，选取使用不同浓度VHH时表观解离速率常数都较小的混合比例作为最优捕获条件；
[0011]2)在最优捕获条件下，利用混合抗体捕获法进行VHH/scFv的筛选：
[0012]先将抗Myc标签抗体和抗His标签抗体以步骤1)中获得的最优混合比例混合，再将混合抗体包被到活化后的芯片上，使VHH/scFv流经所述芯片，并与包被在芯片上的混合抗体发生特异性结合；
[0013]以不同浓度的抗原作为分析物进行SPR检测，分析计算VHH/scFv与抗原的解离速率常数k
d
。
[0014]具体地，步骤1)中，抗Myc标签抗体和抗His标签抗体的混合比例分别为1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、仅添加抗His标签抗体和仅添加抗Myc标签抗体。
[0015]具体地，步骤1)中，所述活化是指利用活化剂活化SPR传感芯片，所述包被是指将混合抗体与SPR传感芯片进行共价偶联。
[0016]具体地，所述SPR传感芯片为CM5芯片，所述CM5芯片在完成结合和解离后，使用浓度为10mmol/L的甘氨酸溶液进行芯片再生，所述甘氨酸溶液的pH值设置为1.5。
[0017]具体地，步骤1)中，所述VHH的稀释浓度分别为0.2μg/mL、1μg/mL和5μg/mL。
[0018]具体地，步骤1)中，所述VHH和混合抗体结合后，解离时间设置为600
‑
3600s。
[0019]具体地，步骤2)中，所述最优混合比例是指按照4：1～7：1的比例混合抗Myc标签抗体和抗His标签抗体，且混合抗体的饱和浓度为30μg/mL。
[0020]具体地，步骤2)中，所述VHH/scFv和抗原的结合时间设置为120s，解离时间设置为1200
‑
1800s。
[0021]具体地，步骤2)中，所述抗原为不含有Myc标签和His标签的抗原，包括但不限于无标签抗原和半Fc标签抗原。
[0022]目前现有技术通常在筛选前期采用ELISA，FACS，后期再配合使用SPR进行VHH/scFv亲和力筛选，存在以下问题：ELISA和FACS方法检测VHH/scFv，仅能够得到定性的结果，且结果容易受到上清表达量高低的影响，容易遗漏一些亲和力较好但表达低的分子；现有的SPR方法检测VHH/scFv，如只通过捕获分子结合VHH/scFv中单一标签进行SPR检测，捕获分子和VHH/scFv的表观解离速率常数通常难以达到理想值，从而对VHH/scFv与抗原的解离速率常数的检测范围产生限制。所以通常要先对VHH/scFv进行纯化或者进行IgG抗体的构建，这又在一定程度上限制了检测通量，同时也会产生额外的时间和成本，也容易遗漏一些亲和力较好但表达量低不易纯化的分子；
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0024]1.因为SPR不受表达量限制，可以实时监测分子间相互作用，将SPR用于前期筛选能够防止遗漏一些亲和力较好但表达较差的分子；
[0025]2.通过混合抗体同时结合VHH/scFv上的两种标签，提高了捕获VHH/scFv的稳定性，从而扩大了VHH/scFv的解离速率常数k
d
值的检测范围，提高解离速率常数k
d
值的准确
度；
[0026]3.使用混合抗体对上清中的VHH/scFv进行捕获筛选，不需要对VHH/scFv进行纯化，也不需要进行IgG的构建，节约了时间和成本，有助于抗体研发阶段大量VHH/scFv样品的动力学结合检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用混合抗体捕获法筛选VHH/scFv的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)优化捕获条件：先将单独的抗Myc标签抗体和单独的抗His标签抗体以不同比例混合，获得混合抗体，对芯片进行活化后，再使用所述混合抗体包被于所述芯片上，使用缓冲液将VHH稀释至不同浓度，使VHH流经所述芯片，并与包被在芯片上的抗体发生特异性结合，进行SPR检测并分析计算包被抗体与VHH的表观解离速率常数即表观k
d
；比较混合比例不同的抗体和不同浓度VHH的表观解离速率常数，选取使用不同浓度VHH时表观解离速率常数都较小的混合比例作为最优捕获条件；2)在最优捕获条件下，利用混合抗体捕获法进行VHH/scFv的筛选：先将抗Myc标签抗体和抗His标签抗体以步骤1)中获得的最优混合比例混合，再将混合抗体包被到活化后的芯片上，使VHH/scFv流经所述芯片，并与包被在芯片上的混合抗体发生特异性结合；以不同浓度的抗原作为分析物进行SPR检测，分析计算VHH/scFv与抗原的解离速率常数k
d
。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，抗Myc标签抗体和抗His标签抗体的混合比例分别为1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、仅添加抗His标签抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：荣乃燕，陈佳婧，周涛，刘洁颖，王卓智，
申请(专利权)人：上海药明生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：