一种检测氨基甲酸乙酯的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测氨基甲酸乙酯的方法，该方法利用氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽代替抗原建立竞争型噬菌体酶联免疫分析法(phage

【技术实现步骤摘要】
一种检测氨基甲酸乙酯的方法


[0001]本专利技术涉及食品安全
，具体地，涉及一种检测氨基甲酸乙酯的方法。

技术介绍

[0002]氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)又名尿烷，在发酵食品食品领域中生产和储存过程中不可避免产生的副产物。大量研究表明氨基甲酸乙酯可以诱导肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等疾病的发生。EC的污染已成为近年来食品安全热点问题之一。2007年，世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)将EC列为2A类致癌物。因此，对发酵食品中的EC分析检测具有重大意义。
[0003]目前，EC检测方法有气相色谱
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质谱法、液相色谱
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质谱法、液相色谱
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荧光法和高效液相色谱
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荧光法等，这些方法虽广泛应用,灵敏度高,但是对样品的前处理具有较高要求，且设备昂贵，无法实现现场快速检验,因此近年来快速，便捷的基于抗原抗体特异性识别原理的酶联免疫吸附法得到迅猛发展。EC由于不含有能够诱导免疫反应的结构,且具有超低的分子量(89.09Da)，至今对其进行高灵敏直接免疫检测未能突破。目前仅能基于检测其衍生物的方式进行免疫分析检测。方法建立过程中，必要的检测全抗原的合成一直存在反应步骤繁琐，合成原料昂贵，制备过程威胁操作人员身体健康的限制因素。中国专利CN201410533042.1公开了一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法；中国专利CN201410365882.1公开了可见分光光度法测定氨基甲酸乙酯含量的方法；中国专利CN201410365881.7公开了薄层色谱法半定量测定氨基甲酸乙酯的方法。
[0004]利用噬菌体展示肽库淘筛得到的模拟表位肽可成功代替免疫分析方法中的完全抗原，建立的异源免疫分析方法比传统的化学抗原免疫分析方法显著提升。该方法筛选方便省时省力，成本低廉，性质稳定，最重要可降低实验人员的暴露有毒环境的风险。模拟表位肽代替抗原在免疫系统分析检测领域具有广阔的应用前景，但目前国内外应用于EC分析检测的模拟表位蛋白尚未报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测氨基甲酸乙酯的方法，其利用氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽代替抗原建立竞争型噬菌体酶联免疫分析法(phage
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ELISA)，用于EC的检测。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一种编码氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽的基因。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供一种噬菌体。
[0009]本专利技术的第四个目的是提供另一种噬菌体。
[0010]本专利技术的第五个目的是提供一种检测氨基甲酸乙酯的方法。
[0011]本专利技术的第六个目的是提供一种检测氨基甲酸乙酯的试剂盒。
[0012]本专利技术的第七个目的是提供所述氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽、所述基因、所
述噬菌体、和/或所述另一噬菌体任意一种或几种在检测氨基甲酸乙酯衍和/或氨基甲酸乙酯衍生物中的应用。
[0013]本专利技术的第八个目的是提供所述氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽、所述基因、所述噬菌体、和/或所述另一噬菌体任意一种或几种在制备检测氨基甲酸乙酯衍和/或氨基甲酸乙酯衍生物的试剂盒中的应用。
[0014]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0015](1)将纯化的氨基甲酸乙酯衍生物单克隆抗体包被在高吸附酶标板上，用3％(w/v)脱脂奶粉封闭酶标板，随后将随机七环噬菌体展示库加入酶标板中进行淘筛，按照结合
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洗脱
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扩增的淘选方案进行，通过3轮的富集淘筛。其中，三轮淘筛包被的抗体用量和用于竞争洗脱噬菌体的EC衍生物用量依次减少；
[0016](2)经过3轮淘筛后，随机挑选40个噬菌体单克隆进行噬菌体ELISA的初步鉴定，对于得到的7个阳性克隆进行扩增，测序共发现3种序列。
[0017]本专利技术利用竞争型模式的淘筛可展示模拟表位肽的噬菌体克隆，展示模拟表位蛋白的噬菌体与待测物(氨基甲酸乙酯的衍生物)，竞争包被在酶标板上的单克隆抗体(该抗体可以特异性识别氨基甲酸乙酯衍生物)。判定阳性噬菌体克隆的依据是，加有噬菌体和PBS的混合物的反应孔有吸光值，即与噬菌体与抗体结合；同时在对照孔中(加入的是噬菌体与PBS稀释的待测物的混合物)吸光值显著降低，即待测物可以把噬菌体从抗体的结合位点上竞争下来，此噬菌体即可展示模拟表位肽的噬菌体克隆。该噬菌体以M13噬菌体质粒为载体，编码外源模拟表位肽的基因插入到噬菌体编码的膜蛋白的gⅢ基因中，使外源蛋白可展示于噬菌体PⅢ壳蛋白的N端。
[0018]因此本专利技术要求保护以下内：
[0019]一种氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3或5所示，氨基甲酸乙酯衍生物结构式如式(I)
[0020][0021]优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0022]该结构式如式(I)的氨基甲酸乙酯衍生物即为占吨聚甲酸乙酯。
[0023]一种编码氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2、4或6所示，氨基甲酸乙酯衍生物结构式如式(I)
[0024][0025]优选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0026]一种噬菌体，所示噬菌体表面表达有所述的氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽。即氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3或5所示氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽和展示于噬菌体PⅢ衣壳蛋白，即展示氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3或5所示氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽的噬菌体。
[0027]优选地，所述氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽展示于噬菌体PⅢ壳蛋白的N端。
[0028]一种噬菌体，所示噬菌体表面表达所述的基因。
[0029]优选地，所述菌体以M13噬菌体质粒为载体，所述基因插入到噬菌体编码的膜蛋白的gⅢ基因中。
[0030]一种检测氨基甲酸乙酯的方法，包括以下步骤：
[0031]S1.待测样本进行衍生化反应，其中的氨基甲酸乙酯的酰胺基团与占吨氢醇的羟基，脱水，生成占吨聚甲酸乙酯；
[0032]S2.以抗氨基甲酸乙酯衍生物抗体作为包被抗体，以所述的氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽、所述噬菌体、所述噬菌体任意一种或几种作为竞争抗原进行酶联免疫检测。
[0033]优选地，所述衍生化反应为：待测样本与占吨氢醇的混合液体，酸性环境下进行衍生化反应，碱性条件下中止衍生化反应。
[0034]最优选地，包括以下步骤
[0035]1、抗体包被
[0036]用PBS稀释抗氨基甲酸乙酯衍生物(占吨聚甲酸乙酯，结构式如式I所示)的单克隆抗体，包被酶标板，孵育过夜。次日，PBST洗涤，封闭，甩干后。
[0037]2、衍生
[0038]待测样品取与占本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3或5所示，氨基甲酸乙酯衍生物结构式如式(I)2.一种编码氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2、4或6所示，氨基甲酸乙酯衍生物结构式如式(I)3.一种噬菌体，其特征在于，所示噬菌体表面表达有权利要求1所述的氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽。4.一种噬菌体，其特征在于，所示噬菌体表面表达权利要求2所述的基因。5.一种检测氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.待测样本进行衍生化反应，其中的氨基甲酸乙酯的酰胺基团与占吨氢醇的羟基，脱水，生成占吨聚甲酸乙酯；S2.以抗氨基甲酸乙酯衍生物抗体作为包被抗体，以权利要求1所述的氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽、权利要求3所述噬菌体、权利要求4所述噬菌体任意一种或几种作为竞争抗原进行酶联免疫检测。6.根据权利要求5所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振林，傅慧君，罗林，王弘，孙远明，沈玉栋，雷红涛，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：