酸性果胶酶分子改造及应用制造技术

本发明专利技术涉及一株高产酸性果胶酶的黑曲霉（Aspergillus niger）菌株的分子改造及其应用。本发明专利技术以黑曲霉（Aspergillus niger）KNPL为出发菌株，通过敲除ligD和pelA两个基因，过表达三个新型pgaA基因，再通过紫外诱变和高通量筛选得到KNPL

【技术实现步骤摘要】
酸性果胶酶分子改造及应用


[0001]本专利技术属于微生物改造
，具体内容涉及一株高产酸性果胶酶的黑曲霉突变菌株及其应用。
技术背景
[0002]果胶是一种由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部可与钙、钾、钠离子，特别是与硼化物结合在一起。果胶存在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，从而表现出固有的形态。
[0003]果胶酶(pectinase)是指能够分解果胶物质的多种酶的总称，大致可分为果胶水解酶(pectin hydrolases)、果胶裂解酶(pentinlyases)、果胶酯酶(pectin esterases) 和原果胶酶等。按照作用最适pH的不同，果胶酶又可分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。
[0004]目前研究和应用较多的是酸性果胶酶，酸性果胶酶指内聚半乳糖醛酸酶，可无规则的水解果胶酸分子中的α-1,4糖苷键，其作用最适pH在偏酸性范围，主要应用于食品行业的水果榨汁和果汁澄清，降低葡萄酒粘度，并可以与其它水解酶共同应用于饲料行业。其主要来源于动植物及微生物，尤其是微生物，因为它的生长速度快、生长条件简单、代谢过程特殊等特征，成为果胶酶的重要来源，其中真菌来源的果胶酶大部分在酸性pH值下具有高活性。大多数商业化生产的果胶酶也是来源于真菌，尤其是来源于黑曲霉和青霉。一些果胶酶基因已被克隆，测序并进行了表达。
[0005]目前采用天然菌株生产的果胶酶存在一些局限性，主要包括产酶性能较低、果胶酶的耐温性能较差以及作用pH范围较小等。因此，随着果胶酶应用越来越广泛，迫切需要对果胶酶生产菌种进行相应的改良，以提高果胶酶的产量。

技术实现思路

[0006]本专利技术为解决现有技术问题，提供了一株高产酸性果胶酶的黑曲霉（Aspergillus niger）菌株及其应用。申请人以筛选得到的野生菌株Aspergillus niger KNPL为出发菌株，通过基因敲除与重组的方法，筛选获得一株突变菌株，能大幅度提高酸性果胶酶的产量，有利于促进该酶的广泛应用。
[0007]本专利技术一方面提供了一种突变株Aspergillus niger KNPL-GCO4。
[0008]本专利技术一方面提供了所述黑曲霉在生产酸性果胶酶中的应用。
[0009]本专利技术还提供了一种生产酸性果胶酶的方法，是以所述黑曲霉为发酵菌株。
[0010]本专利技术还提供了一种酸性果胶酶，是由所述黑曲霉发酵获得的。
[0011]本专利技术以黑曲霉（Aspergillus niger）KNPL为出发菌株，通过敲除ligD和pelA两个基因，过表达三个新型pgaA基因，再通过紫外诱变和高通量筛选得到KNPL-GCO4。所述突变菌株经20L发酵优化后，发酵7d后，其酸性果胶酶酶活达到5万 u/mL，较出发菌提高40%。
本专利技术提供的黑曲霉突变菌株可广泛应用于酸性果胶酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，促进酸性果胶酶的推广与应用。
具体实施方式
[0012]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。
[0013]下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细描述。
[0014]实施例1 黑曲霉KNPL固体摇瓶发酵及酶活检测黑曲霉（Aspergillus niger）KNPL为自行筛选野生菌株。该菌株能发酵生产酸性果胶酶。
[0015]申请人首先将黑曲霉KNPL接种到新鲜的PDA平板（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；琼脂粉1.5%），30℃培养5d。
[0016]吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，接种50ml液体CSL-果糖种子培养基（麦芽糖10%；果糖5%；葡萄糖1%；玉米浆10%；硫酸镁0.05%；磷酸二氢钠0.1%；pH 5.8），30℃培养2d。培养2d后，吸取2ml菌丝体接种5g固体摇瓶培养基，30℃培养3.5d，每天翻曲。培养结束后加40ml无菌水，搅拌2h洗脱，离心获得上清液即为粗酶液。将粗酶液进行酸性果胶酶酶活力测定，结果显示，所述粗酶液中酸性果胶酶酶活达到635u/g，从而说明黑曲霉KNPL确实能够高产酸性果胶酶。
[0017]1、酸性果胶酶酶活力检测（1）酸性果胶酶酶活单位的定义在50℃，pH为3.5条件下，反应1h，1g酶粉或1ml酶液分解果胶产生1mg半乳糖醛酸定义为一个活力单位（IU）。
[0018]（2）酶活测定方法（2.1） 试剂和溶液：1%果胶粉水溶液：秤取果胶粉（Sigma P9135）1g，加水溶解，煮沸冷却，如有不溶物则需进行过滤，调pH 3.5，用水定容至100ml，在冰箱中储存备用，使用时间不超过3d；碳酸钠溶液1mol/L：秤取无水碳酸钠106g，加水溶解，定容至1L；碘标准溶液：0.1mol/L；硫酸溶液2mol/L：取浓硫酸5.6ml，缓慢加入适量水中，冷却后用水定容至100ml；可溶性淀粉指示液：10g/L；0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 3.5）：秤取柠檬酸（C6H8O7·
H2O）14.7098g和柠檬酸三钠（C6H5Na3O7·
2H2O）8.823g，用水溶解并定容至1L；0.05mol/L硫代硫酸钠溶液：将定量分析用的0.1mol/L硫代硫酸钠母液500ml用煮沸过的冷却水稀释，所得溶液的总体积为1000ml。配制好后，应进行标定，求出浓度校正系数f值；
（2.2）样品溶液的制备：准确吸取酶液1ml于一定体积的容量瓶中，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释并定容。酶液需要稀释至一定倍数，酶液浓度应控制在消耗0.05mol/L硫代硫酸钠标准溶液（A-B）之差在0.5~0.7ml范围内。
[0019]（2.3）酶活力测定：在空白管中，分别加入10g/L果胶溶液5ml和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液5ml，在样品管中加入10g/L果胶溶液5ml和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液4ml，在50℃水浴中预热5~10min。
[0020]向样品管中加入1ml稀释好的酶液，立刻摇匀计时，在此温度下准确反应0.5h，立即取出，煮沸5min，终止反应，冷却。
[0021]取上述空白管和样品管反应液各5ml，放入碘量瓶中，准确加入1mol/L碳酸钠溶液1ml、0.1mol/L碘液5ml，摇匀，于暗处放置20m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黑曲霉，其特征在于，所述的黑曲霉为Aspergillus niger KNPL-GCO4。2.权利要求1所述的黑曲霉在生产酸性果胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：周英俊，张慧丹，赵凯，孔垂彬，
申请(专利权)人：山东蔚蓝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：