本发明专利技术提供了一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：制备样品垫，制备反应膜，将所得的样品垫和反应膜搭接在底板上，所述反应膜包括标记区、检测区和质控区，所述标记区设置有荧光标记线，所述检测区包括依次排列的RF检测线、ASO检测线、CRP检测线和CCP检测线，所述质控区包括质控线。通过将四个检测指标，同时制备到一个试纸条上，使检测试纸条只需一根，达到真正意义上的一次上样同时出来四个检测结果，可以极大的降低试纸条生产成本，并且操作简单方便，重复性好，同时样本量需求少，只需单次上样，大大缩短加样时间和检测等待时间。时间和检测等待时间。时间和检测等待时间。
【技术实现步骤摘要】
一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法
[0001]本专利技术涉及生物检测装置领域，具体地说，是涉及一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法。
技术介绍
[0002]类风湿因子（RF）是一种抗人或动物IgG分子Fc片段抗原决定簇的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体，存在于类风湿性关节炎患者及某些自身免疫性疾病患者血清或关节液内，正常人体内基本没有或含量很低，阳性常见于类风湿性关节炎患者（RA），某些免疫性疾病如SLE、皮肌炎、干燥综合症等。
[0003]链球菌溶血素"O"（SLO）是A族溶血性链球菌的重要代谢产物之一，它是一种具有溶血活性的蛋白质，能溶解人及一些动物的红细胞。同时链球菌溶血素"O"具有抗原性，能刺激机体产生相应的抗体，故也称抗“O”（ASO）。A族溶血性链球菌在人体中作为正常菌群存在，正常人体内的ASO具有一定的基础值。ASO主要用于协助诊断风湿病，当存在链球菌感染时，其效价会升高，风湿热、急性肾小球肾炎、结节性红斑、猩红热、急性扁桃体炎等ASO明显升高，少数肝炎、结缔组织病、结核病及多发性骨髓瘤病人亦可使ASO增高。
[0004]C
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反应蛋白（CRP）是急性时相反应蛋白，正常情况下含量极微量，在急性创伤和感染时其血浓度急剧升高，类风湿关节炎活动时CRP一般轻度或中度增高，急性风湿热活动期CRP可非常明显增高。因此CRP是协助诊断风湿与类风湿疾病的指标，亦是区分病情活动与非活动，改善或恶化，疗效的敏感指标。
[0005]抗环瓜氨酸多肽抗体(anti
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CCP)，是一个环状聚丝蛋白的多肽片段，是以IgG型为主的抗体，是由类风湿患者的B淋巴细胞自发分泌的一种免疫球蛋白，而其他疾病患者和正常人群的B淋巴细胞一般不自发分泌抗CCP抗体。因此，对于类风湿关节炎具有高度的特异性。
[0006]CN 104459140 B公开了一种定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素 O、抗环瓜氨酸肽抗体、C反应蛋白的检测试剂盒，该试剂盒采用荧光微球免疫层析法，但该方法试剂卡互相独立，一卡一项，生产相对复杂，且荧光微球标记效率较低。CN 204882563 U公开了一种类风湿关节炎试剂盒，该试剂盒采用胶体金法同时检测RF、CCP和CRP，操作简便快速，易观察，但胶体金免疫层析法具有准确性和稳定性不高的局限性。
[0007]目前市面上尚缺少可以一卡同时、快速、准确、定量检测上述四项指标的检测试剂盒。
技术实现思路
[0008]本专利技术的目的在于克服上述传统技术的不足之处，提供一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法。
[0009]1. 本专利技术的目的是通过以下技术措施来达到的：一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：制备样品垫，制备反应膜，将所得的样品垫和反应膜
搭接在底板上，所述反应膜包括标记区、检测区和质控区，所述标记区设置有荧光标记线，荧光标记线为用荧光物质对山羊抗人IgM单克隆抗体、ASO抗原、鼠抗人CRP单克隆抗体和CCP抗原进行标记，将标记好的鼠抗人CRP单克隆抗体、山羊抗人IgM单克隆抗体、ASO抗原和CCP抗原溶液分别按体积1：1：1：1进行混合调配，并且搅拌均匀待用，按照1.3μL/cm喷涂在试纸条的标记区形成；所述检测区包括依次排列的RF检测线、ASO检测线、CRP检测线和CCP检测线，CRP检测线、ASO检测线、RF检测线和CCP检测线为将鼠抗人CRP抗体、RF抗原、ASO抗原和CCP抗原用包被液稀释到1～1.5mg/mL，以1.0μL/cm的喷量依次喷涂在检测区形成；所述质控区包括质控线，质控线为将羊抗鼠IgG抗体用包被液稀释到1mg/mL，以1.0μL/cm的喷量依次喷涂在质控区形成；用样本稀释液稀释样本，将稀释后的样本加到样品垫上检测；荧光物质标记工艺包括以下步骤：抗体的准备：每50μL体系中，准备0.2mg山羊抗人IgM单克隆抗体，0.2mgASO抗原，0.2mg鼠抗人CRP单克隆抗体，0.2mg CCP抗原，放于室温平衡20min；荧光素的准备：荧光素用DMSO溶解至1μmol/L备用；标记：将每50μL体系中加入2μL荧光素的比例进行配比，加入到备好的的蛋白液中，搅拌混匀，剩余体积用pH 9.5碳酸氢钠补足，反应2h；透析：标记完成抗体，用透析液PBS、1%BSA、0.5%PEG、5%海藻糖稀释十倍，在PBS缓冲液中透析12小时以上即得标记好的荧光抗体。
[0010]试剂盒采用免疫荧光双抗体/抗原夹心法定量检测人血清、血浆和全血中RF/ASO/CRP/CCP的含量。当样本中含有RF/ASO/CRP/CCP时，RF/ASO/CRP/CCP分别与检测板上荧光标记的山羊抗人IgM抗体、荧光标记的ASO抗原、荧光标记的鼠抗人CRP单克隆抗体、荧光标记的CCP抗原结合形成复合物，通过层析作用扩散到检测线时分别与包被的RF抗原、ASO抗原、鼠抗人CRP单克隆抗体、CCP抗原结合。因此样本中RF/ ASO/ CRP/CCP含量越高，检测线上复合物积累量越多。荧光抗体的信号强度反映了被捕获的RF/ASO/CRP/CCP数量。
[0011]作为一种优选方案，所述荧光素为Biotium公司的CF647荧光染料。
[0012]作为一种优选方案，所述包被液为称量Na2HPO4·
12H2O 2.9g，KH2PO
4 0.24g,NaCl 8g,KCl 0.2g,海藻糖10g,溶解于超纯水，用NaOH调pH至7.4，定容至1000 mL制备所得。
[0013]作为一种优选方案，所述包被液为海藻糖5g，Tris 1.21g，溶解于超纯水，用HCl调解PH值至8.0，然后定容至1L制备所得。
[0014]作为一种优选方案，样本稀释液为称量Na2HPO4•
12H2O 2.865g，NaH2PO4•
2H2O0.272g，NaCl 7.948g，Tween
‑
20 1mL，TX
‑
100 1mL， BSA 5g，加入到烧杯中，溶解于超纯水，用NaOH调pH至7.4，定容至1000mL制备所得。
[0015]作为一种优选方案，样本稀释液为称量Tris 1.21g，Tween
‑
20 1mL，Triton X
‑
100 1mL，BSA 5g，加入到烧杯中，溶解于超纯水，用HCl调pH至8.0，定容至1000mL制备所得。
[0016]作为一种优选方案，所述样品垫为玻璃纤维或硝酸纤维素膜或全血过滤垫。
[0017]作为一种优选方案，所述样品垫的制备方法为:放于样品垫处理液中浸泡后，取出于37℃干燥箱中干燥12小时然后加入干燥剂封存。
[0018]作为一种优选方案，所述样品垫处理液为含有1%BSA、0.05% Tween
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20和0.05%叠氮钠的磷酸盐缓冲溶液。
[0019本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：制备样品垫，制备反应膜，将所得的样品垫和反应膜搭接在底板上，所述反应膜包括标记区、检测区和质控区，所述标记区设置有荧光标记线，荧光标记线为用荧光物质对山羊抗人IgM单克隆抗体、ASO抗原、鼠抗人CRP单克隆抗体和CCP抗原进行标记，将标记好的鼠抗人CRP单克隆抗体、山羊抗人IgM单克隆抗体、ASO抗原和CCP抗原溶液分别按体积1：1：1：1进行混合调配，并且搅拌均匀待用，按照1.3μL/cm喷涂在试纸条的标记区形成；所述检测区包括依次排列的RF检测线、ASO检测线、CRP检测线和CCP检测线，CRP检测线、ASO检测线、RF检测线和CCP检测线为将鼠抗人CRP抗体、RF抗原、ASO抗原和CCP抗原用包被液稀释到1～1.5mg/mL，以1.0μL/cm的喷量依次喷涂在检测区形成；所述质控区包括质控线，质控线为将羊抗鼠IgG抗体用包被液稀释到1mg/mL，以1.0μL/cm的喷量依次喷涂在质控区形成；用样本稀释液稀释样本，将稀释后的样本加到样品垫上检测；荧光物质标记工艺包括以下步骤：抗体的准备：每50μL体系中，准备0.2mg山羊抗人IgM单克隆抗体，0.2mgASO抗原，0.2mg鼠抗人CRP单克隆抗体，0.2mgCCP抗原，放于室温平衡20min；荧光素的准备：荧光素用DMSO溶解至1μmol/L备用；标记：将每50μL体系中加入2μL荧光素的比例进行配比，加入到备好的的蛋白液中，搅拌混匀，剩余体积用pH9.5碳酸氢钠补足，反应2h；透析：标记完成抗体，用透析液PBS、1%BSA、0.5%PEG、5%海藻糖稀释十倍，在PBS缓冲液中透析12小时以上即得标记好的荧光抗体。2.根据权利要求1所述的一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：所述荧光素为Biotium公司的CF647荧光染料。3.根据权利要求1所述的一卡式定量检测RF、ASO、CRP和CCP的检测板的制备方法，其特征在于：所述包被液为称量Na2HPO4·
12H2O2.9g，KH2PO40.24g,NaCl8g,KCl0.2g,海藻糖10g,溶解于超纯水，用NaOH调pH至7...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，朱楠楠，张艳，杨金红，李元盛，
申请(专利权)人：青岛汉唐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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