耐受农药酷拉斯的小麦纹枯病生防贝莱斯芽孢杆菌及应用制造技术

本发明专利技术公开了耐受农药酷拉斯的小麦纹枯病生防贝莱斯芽孢杆菌及应用，属于农业微生物领域。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，命名为NW03，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.22694。本发明专利技术贝莱斯芽孢杆菌对农药酷拉斯具有良好的耐受性，并且对小麦纹枯病病原菌具有良好的拮抗作用，可与酷拉斯共用进行小麦纹枯病的防治，在保证防效的基础上实现农药减量。药减量。药减量。

【技术实现步骤摘要】
耐受农药酷拉斯的小麦纹枯病生防贝莱斯芽孢杆菌及应用


[0001]本专利技术涉及农业微生物
，更具体的说是涉及耐受农药酷拉斯的小麦纹枯病生防贝莱斯芽孢杆菌及应用。

技术介绍

[0002]小麦纹枯病也被称为立枯病、尖眼点病，是由小麦喙角担菌的侵染引起的病原性真菌感染病害。小麦的叶鞘及其茎杆容易沾染该疾病，随着时间的推移，沾染病菌的部位逐渐向外延伸，发病前缓后急。小麦在每个生育期都可能遭受该病害，造成倒伏、烂芽、枯孕穗、死苗等多种表现。
[0003]农药酷拉斯可高效防治小麦纹枯病，能够长久地对小麦进行保护，并促进小麦生长，在常规的基础上降低小麦播种量，提高产量。酷拉斯的有效成分是噻虫嗪、咯菌腈、苯醚甲环唑；其可抑制病原菌，有效促进农作物正常生长，提高作物产量。然而，随着农药滥用的问题日益严重，病原菌的耐药性逐渐增强，继续加大农药量的使用会影响农作物的生长，不但会造成农药污染，还会影响农作物的品质，因此，农药减量化已发展为必然趋势。
[0004]将生防菌与农药杀菌剂混合搭配施用，一方面可大大降低农药成本，减少农药残留、农药对植物的负面影响以及农药对人体的安全风险，另一方面又可以发挥生防菌防治病害的效用，保障防治病害的效果，解决病害耐药性增强的问题。因此，亟待提供能够与酷拉斯相容的病原菌拮抗菌，探索生防菌与化学农药混配的可能性，为提高生防菌的作用效果、降低种植户生产成本提供有效途径。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了耐受农药酷拉斯的小麦纹枯病生防贝莱斯芽孢杆菌，其对农药酷拉斯具有良好的耐受性，并且对小麦纹枯病病原菌具有良好的拮抗作用，可与酷拉斯共用进行小麦纹枯病的防治，在保证防效的基础上实现农药减量。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]耐受农药酷拉斯的小麦纹枯病生防贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，命名为NW03，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22694，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2021年06月11日。
[0008]上述耐受农药酷拉斯的小麦纹枯病生防贝莱斯芽孢杆菌在防治小麦纹枯病中的应用。
[0009]进一步地，防治小麦纹枯病时，对小麦施用农药酷拉斯并且接种上述贝莱斯芽孢杆菌。
[0010]由上述技术方案可知，本专利技术公开的贝莱斯芽孢杆菌NW03对酷拉斯具有较强的耐受作用；与酷拉斯共用，在酷拉斯减半的情况下即可达到与单独使用酷拉斯相似的防治效果，适于推广应用。
附图说明
[0011]图1所示为筛选获得的部分耐受农药酷拉斯的芽孢杆菌；
[0012]图2所示为部分筛选菌株对小麦纹枯病菌的拮抗效果；
[0013]图3所示为拮抗菌株在含有酷拉斯的培养基中的生长情况；
[0014]图4所示为NW03菌株菌落形态；
[0015]图5所示为NW03菌株系统发育树。
具体实施方式
[0016]下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0017]实施例1NW03的分离筛选及鉴定
[0018]1.试验材料
[0019]小麦植株样品取自河北农业大学农场小麦种植地，样品采集的时间是2019年4月份。小麦纹枯病病原菌由本实验室保存。试验用小麦品种为冀麦418，产地保定，无包衣。
[0020]2.培养基
[0021]PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL。将马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸0.5h，用双层纱布过滤，取其滤液加糖，并加水补足1000mL。
[0022]NA培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2。
[0023]NB培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2。
[0024]3.小麦纹枯病病原菌的培养
[0025]将灭菌的PDA培养基融化后倒平板，加入硫酸链霉素使其终浓度为40μg/100mL。将小麦纹枯病病原菌菌片接种于PDA平板中央，26℃培养箱培养5
‑
7d，待菌丝长满板备用。
[0026]4.耐受酷拉斯农药的芽孢杆菌的筛选
[0027]将小麦幼苗根部用清水洗净，用无菌滤纸将水吸干，用75.0％酒精对小麦根部进行表面消毒，在无菌研钵中碾碎，将研碎的幼苗根部组织放入灭菌的250mL锥形瓶中(锥形瓶里含100mL无菌水和玻璃珠)，震荡摇匀30min，水浴锅中80℃水浴加热5min，通过稀释涂布法在含有农药酷拉斯(终浓度为100μL/100mL)的NA平板上分离筛选耐受酷拉斯的芽孢杆菌。37℃培养过夜，对筛选出的耐受酷拉斯的菌株进行统计编号。
[0028]经初步筛选，从小麦根部组织中筛选出了106株能够耐受酷拉斯农药的芽孢杆菌(图1)。
[0029]5.拮抗小麦纹枯病菌的芽孢杆菌的筛选
[0030]利用病原菌作为指示菌，采用对峙培养法进行拮抗试验，检测筛选的耐受酷拉斯的菌株生成抑菌带情况，筛选拮抗小麦纹枯病病原菌的菌株。
[0031]将小麦纹枯病病原菌菌片放置在PDA平板中央，用无菌竹签挑取筛选的菌株接种到距离病原菌片2.5cm的位置，每个平板均匀接种4
‑
5个单菌落，26℃培养箱倒置培养5
‑
7d。将能够产生明显抑菌带的拮抗细菌接种到NA斜面，37℃恒温培养过夜备用。
[0032]对小麦纹枯病病原菌有抑制作用的菌株有64株，部分结果如图2所示；其中6株拮抗效果显著，对小麦纹枯病病原菌的抑菌带宽度均达到1.5cm以上。
[0033]6.拮抗菌的生长特性检测
[0034]将筛选的对病原菌有显著拮抗活性的菌株在含有酷拉斯(终浓度为100μL/100mL)的NB培养基中37℃恒温震荡培养，每隔24h检测各菌株在600nm下的吸光值，培养时间为96h，并且设置不添加农药酷拉斯的对照组(选用菌株为实验室前期筛选的用于工业生产的芽孢杆菌菌株Z
‑
5)。记录好吸光值，绘制生长曲线。如图3所示，NW03菌株发酵液的浓度在培养72h达到最大值，高于不添加酷拉斯的对照组，表明该菌株对酷拉斯有很强的耐受能力，其生长不受酷拉斯的抑制，之后有所下降，在培养96h略低于对照组。而其余5株菌株在含有酷拉斯的培养基中生长受到显著抑制。
[0035]7.菌株鉴定
[0036]NW03菌株在NA平板上生长的菌落成圆形或者椭圆形，乳白色，表面湿润光滑，中间凸起(图4)。依据《伯杰氏细菌鉴定手册》的方法对筛选的菌株进行种属鉴定。利用通用引物27f和1495r扩增筛本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.耐受农药酷拉斯的小麦纹枯病生防贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其特征在于，命名为NW03，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22...

【专利技术属性】
技术研发人员：张冬冬，肖嘉文，刘兆厦，张学超，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：