一株高产抗肝癌胞外多糖的枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一株高产抗肝癌胞外多糖的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其应用。所述枯草芽孢杆菌是从辽宁省自然发酵豆酱中分离筛选得到，保藏号为CGMCC No.23141，其胞外多糖产量高达3.04g/L，且具有良好的抗氧化能力和保湿功能，并对人肝癌HepG2细胞具有显著的抑制作用，有望开发成新的抗癌天然药物。有望开发成新的抗癌天然药物。有望开发成新的抗癌天然药物。

【技术实现步骤摘要】
一株高产抗肝癌胞外多糖的枯草芽孢杆菌及其应用


[0001]本专利技术涉及功能微生物筛选与应用
，具体地涉及一株高产抗肝癌胞外多糖的枯草芽孢杆菌及其应用。

技术介绍

[0002]肝癌是我国常见的恶性肿瘤和致死病因，是全球致死率第二的癌症。在亚洲国家，肝癌发病率很高，发病率为2％～6％，而在一些欧洲国家，肝癌发病率仅有0.25％，我国是肝癌高发国家，发病率和死亡率均高于世界平均水平，且有将近于全球过半的肝癌病人。肝癌的男性患者比女性患者多很多，且在我国，南方地区肝癌患病率较高、农村发病率高于城市。近十几年来，肝癌发病率急速上升，且越来越年轻化。肝癌形成会促使压迫并破坏周围脏器，出现出血、脏器破裂的现象，生长在肝门部还会引起黄疸，严重发展会致使肝肾功能衰竭，继而引起全身衰竭，直至死亡。
[0003]肝癌的最主要治疗方式为手术治疗，但一些患者并不适合手术治疗，也有一些药物能用于癌症晚期诊疗。目前临床用于治疗肝癌的常用药物为仑伐替尼和索拉非尼等分子靶向药物，以及一些免疫药物和其他细胞毒性药物，但细胞毒性药物对肝脏损伤大，可能会加重肝硬化，激活乙肝病毒。临床试验证明，索拉非尼仅能延长大概三个月生存期，且极易产生耐药性，促使肿瘤转移。为改善临床症状，提高药物敏感性，迫切需要天然新型药物来替代传统药物。目前天然药物研究种类较多，中药或植物中含有多种抑制癌症的多糖类、酮类等有效成分，试验研究表明其对癌症治疗明显有效。目前应用于肝癌治疗的天然药物有莪术油、芝麻籽、淫羊藿等，天然药物来源安全，毒副作用小，并且具有广谱活性，抗肿瘤的同时还能提高免疫，抗炎抗病毒。
[0004]微生物胞外多糖作为一种新型天然抗癌活性物质，有作为抗癌药物的巨大发展前景，植物来源的天然药物种植周期长，人力物力耗费高，成本大，微生物生产则能完美解决此类问题。微生物生长周期短，安全性高，所需场地小，成本相对较低。且近年来多种微生物胞外多糖关于抑制癌症的研究广泛，研究结果均证明微生物胞外多糖具有良好的抗癌效果。例如肠膜明串球菌SN
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8胞外多糖的研究中，对于人肝癌细胞HepG2的最大抑制率达到了68.42％；小球藻胞外多糖对宫颈癌细胞作用，细胞凋亡率最大能达到43.56％；隐球酵母S20所产胞外多糖能诱导非小细胞肺癌细胞自噬，达到抑制肺癌的目的等。
[0005]胞外多糖的生产常通过醇沉法先得到粗多糖，再用凝胶色谱柱纯化，干燥后得纯化多糖。微生物胞外多糖是天然抗癌药物的优良选择，但是没有应用于临床的局限主要在菌株产量不高，并且易受到培养基、环境等多种因素影响，如何改善产量问题及提高治疗效果需要进行深入研究。
[0006]鉴于癌症治疗的天然药物市场的需求，急需开发新型高效的天然药物，目前大多数天然药物来源于陆地，但土地资源稀缺，耗费人力，微生物来源的天然药物明显更具优势，搜寻更高产、效益更强的胞外多糖生产菌株也迫在眉睫，对癌症治疗天然药物的扩展及微生物资源的利用具有重要意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一株高产抗癌胞外多糖的枯草芽孢杆菌及其应用。所述枯草芽孢杆菌是从辽宁省自然发酵豆酱中分离筛选得到，其胞外多糖产量高，且具有良好的抗氧化能力和保湿功能，并对人肝癌HepG2细胞具有显著的抑制作用，有望开发成新的抗癌天然药物。
[0008]本专利技术一方面涉及一种枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌SNBS
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6(Bacillus subtilis SNBS
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6)，已于2021年8月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.23141。
[0009]本专利技术一方面涉及枯草芽孢杆菌SNBS
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6在胞外多糖生产中的应用。
[0010]本专利技术还提供一种发酵生产胞外多糖的方法，包括如下步骤：
[0011](1)将枯草芽孢杆菌SNBS
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6接种于产糖培养基中进行发酵，得发酵液；
[0012](2)将发酵液离心，得上清液；
[0013](3)将上清液中加入至少3倍体积的无水乙醇，静置；
[0014](4)离心，收集沉淀，即为胞外多糖。
[0015]优选地，所述的产糖培养基中各组分及其含量分别为：胰蛋白胨10g/L、5g酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、蔗糖20g/L。
[0016]优选地，所述的发酵条件为：发酵温度32
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37℃，发酵时间36
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48h，发酵pH7.0，摇床转速160r/min。
[0017]本专利技术还提供了一种胞外多糖，是通过上述方法制备得到的。
[0018]所述的胞外多糖包含EPS
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1和EPS
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2两种多糖。其中，EPS
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1包含果糖、葡萄糖和半乳糖；EPS
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2包含果糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。
[0019]本专利技术还提供了所述胞外多糖在化妆品、食品、保健品或药品生产中的应用。
[0020]本专利技术还提供了一种抗肝癌保健益生菌粉，其各组分及重量份数分别为枯草芽孢杆菌SNBS
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6冻干菌粉8
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10份、低聚果糖25
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30份、麦芽糊精15
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20份、橘子粉20
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25份、木糖醇5
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10份、菊粉15
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20份。
[0021]所述枯草芽孢杆菌SNBS
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6冻干菌粉的制备方法，包括如下步骤：
[0022](1)枯草芽孢杆菌SNBS
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6菌泥的制备
[0023]将枯草芽孢杆菌SNBS
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6接种于50mL LB基础培养基中，32
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37℃培养12
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24h。再按2％的接种量于250mL LB液体培养基中二次活化，32
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37℃培养12
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24h。最后将活化好的枯草芽孢杆菌SNBS
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6以5％接种量于10L发酵罐中进行高密度厌氧培养，于37℃、pH6.0的条件下培养12
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24h，得到发酵液；10000xg、4℃离心10
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15min，弃上清，收集菌体沉淀，用pH7.0的无菌磷酸盐缓冲液漂洗菌体1次，即得到枯草芽孢杆菌SNBS
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6菌泥；
[0024](2)冻干保护剂的制备
[0025]冻干保护剂包含质量体积比为10％的脱脂乳粉，5％的乳糖，2％的谷氨酸钠，2％的甘油，以水作为溶剂，于105℃灭菌5min；
[0026](3)冻干菌粉的制备
[0027]将枯草芽孢杆菌SNBS
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6菌泥以1:5的质量体积比与保护剂溶液充分搅拌混匀；混合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.23141。2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在胞外多糖生产中的应用。3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备饲料添加剂、食品、保健品或药品中的应用。4.一种发酵生产胞外多糖的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：(1)将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌接种于培养基中进行发酵，得发酵液；(2)将发酵液离心，得上清液；(3)将上清液中加入至少3倍体积的无水乙醇，静置；(4)离心，收集沉淀，即为胞外多糖。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的培养基中各组分及其含量分别为：胰蛋白胨10g/L、5g酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、蔗糖20g/L；所述的发酵条件为：发酵温度32
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37℃，发酵pH7.0，摇床转速160r/min，发酵时间36
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48h。6.一种胞外多糖，其特征在于，所述胞外多糖是通过权利要求4或5所述方法制备得到的。7.权利要求6所述的胞外多糖在化妆品、食品、保健品或药品生产中的应用。8.一种抗肝癌保健益生菌粉，其特征在于，所述益生菌粉中各组分及重量份数分别为枯草芽孢杆菌冻干菌粉8
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10份、低聚果糖25
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30份、麦芽糊精15
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20份、橘子粉20
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25份、木糖醇5
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【专利技术属性】
技术研发人员：武俊瑞，乌日娜，韩琦，汪聪，晏春悦，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：