炭耦合复合型菌剂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物质资源化利用和环境污染物治理技术领域，特别是一种炭耦合复合型菌剂的制备方法；包括步骤S1、将可炭化天然材料进行处理；S2、采集典型污染点位土壤的土壤样品，通过原位培养法分离培养目标菌种；S3、进行驯化，得到能在重金属胁迫下对目标污染物有降解能力的菌种；S4、分离纯化，得到降解菌的纯菌落；S5、重复步骤S4，收集至少3个菌体，富集培养至OD600=1.0～1.2，收集菌液冷冻保存；S6、将多种菌液混合得到复合菌种子液；S7、将复合菌种子液与炭基材料混合培养，进行固定化处理，得到复合型菌剂；本发明专利技术的方法可获得在重金属的胁迫下，降解环境中目标污染物的含量、固定重金属并改善土壤质量的炭藕合复合型菌剂。金属并改善土壤质量的炭藕合复合型菌剂。金属并改善土壤质量的炭藕合复合型菌剂。

【技术实现步骤摘要】
炭耦合复合型菌剂及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物质资源化利用和环境污染物治理
，特别是一种炭耦合复合型菌剂及其制备方法与运用。
[0002]
技术介绍

[0003]全国土壤环境情况并不乐观，在加大生产力发展的同时，也对水体和土壤造成了严重的损坏。而其中，又以南方土壤问题最为突出，其主要原因是由于工业产业的不断发展。据估计，我国受农药、重金属等污染的土壤面积达数十万km2，其中矿区污染土壤达2万 km2、石油污染土壤约5万km2、固废堆放污染土壤约500km2，已对我国生态环境质量、食品安全和社会经济持续发展构成严重威胁。人类活动是造成土壤污染的主要因素，农药污染源、，部分重金属污染物带有较大的毒性，并且具有较强迁移性。在经济发达的沿海地区,土壤污染的状况十分复杂，土壤污染呈现多样性和复杂性特点,表现为污染途径的多样性（大气污染型、水污染型、固体污染型等）和污染来源的多样性（工业污染源、农业污染源、生活污染源、交通污染源、地质作用等）。由单一污染物的研究向复合污染物研究的发展，是当代环境问题的典型趋势，也是修复手段趋向成熟的阶段。
[0004]多环芳烃和重金属都是环境中的微量持久性污染物，可同时在环境中被检测到。多环芳烃被认为是致癌性、致畸性和致突变性污染物，其中菲(Phe)、芘(Pyr)和苯并[a]芘(BAP)因具普遍性和分布性而被广泛讨论。从土壤中清除多环芳烃是当务之急，因为它们通过食物链对人类健康构成严重威胁。但在重金属存在的情况下，多环芳烃的修复具有挑战性，因为重金属会影响ATP的产生、C
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矿化、群落转移和酶功能等，从而损害微生物活性。
[0005]
技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供能在重金属胁迫下降解有机污染物的一种炭耦合复合型菌剂的制备方法。
[0007]本专利技术提供的技术方案是：一种炭耦合复合型菌剂的制备方法，包括以下步骤：S1、将可炭化天然材料进行处理，得到炭基材料，作为后续耦合材料之一；S2、采集典型污染点位土壤的土壤样品制得土壤悬浮液，使用扩散室原位培养法对土壤中的微生物进行分离培养，得到含有目标菌株的土壤微生物富集液；S3、对富集液进行多个周期的菌种筛选驯化，得到能在重金属胁迫下对多环芳烃有降解能力的菌种；S4、对上述有降解能力的菌种使用平板涂布法进行分离纯化，得到降解菌的纯菌落；S5、重复步骤S4，分别收集至少3个菌种纯化后的菌体，用LB液体培养基富集培养
至OD600=1.0～1.2，收集菌液冷冻保存；S6、将活化后的多种菌液以一定的比例进行混合，得到复合菌种子液，作为耦合材料之一；S7、将复合菌种子液与炭基材料按比例混合培养一段时间后，进行固定化处理，得到复合型菌剂。
[0008]优选地，步骤S1中所述的可炭化天然材料包括玉米秸秆、螃蟹壳、茄子秆、竹叶、木棉纤维和鹿粪中的一种或多种。
[0009]优选地，步骤S1中通过以下步骤将可炭化天然材料进行处理：S11、将可炭化天然材料洗净除杂、干燥并粉碎为粉末；S12、经过300～700 ℃隔氧闷烧高温慢裂解1～3小时；S13、在保护气体和冷凝循环水保护下冷却至室温，依次经过研磨过筛，盐酸浸泡活化，蒸馏水洗涤和烘干后得到炭基材料。
[0010]优选地，所述典型污染点位土壤是指农药污染农田、石油烃污染土壤、红树林根系土壤、制造工厂附近土壤或干涸泥床土壤。
[0011]优选地，所述的土壤悬浮液通过以下方法制得：称取10g土壤样品，加入90ml灭菌超纯水，混匀后进行超声处理，然后静置30～60min，获取含有微生物的上清液；超声处理条件为超声波振幅40μm，超声时间为10s，间隔5s，进行2次。
[0012]优选地，步骤S2中，扩散室原位培养法的过程如下：S100、配制原位培养基：取土壤采样点附近的水1L，自然pH值，加入1%(wt/vol)琼脂粉混匀，高温灭菌后降温至45℃，得到温琼脂；S200、接种和组装扩散室：将已灭菌的0.03μｍ孔径聚碳酸酯膜用密封胶与已灭菌的不锈钢垫圈的底面贴好，向中空内环引入土壤悬浮液和温琼脂的混合物，然后将0.03μｍ孔径聚碳酸酯膜和不锈钢垫圈顶面用胶水密封，形成一个密封室；S300、将扩散室埋于原始采样位置或模拟自然环境中进行孵育，深度为5～10cm；孵育1周后，将原位培养装置取回、清洁后，将原位培养基转移到无菌1.5ml的EP管中，加入无菌水，将原位培养基捣碎并充分与无菌水混匀，离心得到菌悬液。
[0013]优选地，步骤S3中，菌种驯化的过程如下：吸取步骤S2中的菌悬液涂布于新扩散室的驯化培养基中，使用扩散室在原位培养四个驯化周期，每周期将菌悬液转接到新构建的 扩散室中，设置四个不同浓度梯度的驯化培养基，在原位培养基中添加一定浓度的有机污染物和重金属进行筛选和驯化能在胁迫下对目标污染物有降解能力的菌种。
[0014]优选地，步骤S7中，复合菌种子液与炭基材料按1:10～30（w/v）的比例混合培养。
[0015]优选地，步骤S7中，所述的固定化处理为将复合菌液与炭基材料按照1:10～30（w/v）的比例混合培养12～24h，完成吸附耦合后，在无菌环境下过筛网，保留固体材料并干燥。
[0016]优选地，步骤S7中，所述的固定化处理为将复合菌种子液与炭基材料按比例混合培养一段时间后，加入等体积的耦合辅助剂，搅匀后逐滴滴入固化液中，固化或凝胶化后用无菌水反复清洗，自然晾干。
[0017]优选地，所述研磨过筛是经过20～100目筛；所述盐酸溶液浓度为1～3 mol/L。
[0018]优选地，收集3种菌液，并将3种菌液以1:1:1、1:1:2、1:2:1或2:1:1的比例进行混合。
[0019]优选地，所述的等体积的耦合辅助剂和对应的固化液为3%～5%的海藻酸钠对应2%氯化钙溶液作固化液或4%～6%的壳聚糖对应1mol/L氢氧化钠作固化液。
[0020]本专利技术还提供了一种采用上述的炭耦合复合型菌剂的制备方法制备得到的炭耦合复合型菌剂。
[0021]本专利技术同时也提供了上述的炭耦合复合型菌剂在污染物治理和土壤修复中的应用。
[0022]本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术制备工艺简单，经济成本低，利用玉米秸秆、螃蟹壳、竹叶、茄子杆和鹿粪等废弃生物质为载体材料，利用污染土壤自行提取合成目的菌群，价格低廉，原料充足易得，且材料的组合搭配具有灵活性，实验室内即可完成，不仅可将废弃资源二次利用且有益于环境保护；2、本专利技术首次利用茄子杆、鹿粪、螃蟹壳制成炭基材料作为耦合载体使用，并且首次将壳聚糖用作耦合辅助剂制备菌炭凝胶球，为制备特定功能的固定化菌剂提供更多选择；3、本专利技术使用扩散室原位培养法分离筛选目标菌株，扩散室旨在通过创建一种非常接近于自然栖息地的孵化策略，从根本上“诱骗”细胞认为它们是在自然环境中生长的；与传统的实验室培养方法相比，原位培养法可能获取到传统“不可培养”微生物，也能使菌株保持自然环境与微生物之间的共生关系，最重要的一点是，可以控制获取的目标菌株不脱离其治理本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种炭耦合复合型菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、将可炭化天然材料进行处理，得到炭基材料，作为后续耦合材料之一；S2、采集典型污染点位土壤的土壤样品制得土壤悬浮液，使用扩散室原位培养法对土壤中的微生物进行分离培养，得到含有目标菌株的土壤微生物富集液；S3、对富集液进行多个周期的菌种筛选驯化，得到能在重金属胁迫下对多环芳烃有降解能力的菌种；S4、对上述有降解能力的菌种使用平板涂布法进行分离纯化，得到降解菌的纯菌落；S5、重复步骤S4，分别收集至少3个菌种纯化后的菌体，用LB液体培养基富集培养至OD600=1.0～1.2，收集菌液冷冻保存；S6、将活化后的多种菌液以一定的比例进行混合，得到复合菌种子液，作为耦合材料之一；S7、将复合菌种子液与炭基材料按比例混合培养一段时间后，进行固定化处理，得到复合型菌剂。2. 如权利要求1所述的炭耦合复合型菌剂的制备方法，其特征在于：步骤S1中所述的可炭化天然材料包括玉米秸秆、螃蟹壳、茄子秆、竹叶、木棉纤维和鹿粪中的一种或多种。3.如权利要求1所述的炭耦合复合型菌剂的制备方法，其特征在于：步骤S1中通过以下步骤将可炭化天然材料进行处理：S11、将可炭化天然材料洗净除杂、干燥并粉碎为粉末；S12、经过300～700 ℃隔氧闷烧高温慢裂解1～3小时；S13、在保护气体和冷凝循环水保护下冷却至室温，依次经过研磨过筛，盐酸浸泡活化，蒸馏水洗涤和烘干后得到炭基材料。4.如权利要求1所述的炭耦合复合型菌剂的制备方法，其特征在于：所述典型污染点位土壤是指农药污染农田、石油烃污染土壤、红树林根系土壤、制造工厂附近土壤或干涸泥床土壤。5.如权利要求1所述的炭耦合复合型菌剂的制备方法，其特征在于：所述的土壤悬浮液通过以下方法制得：称取10g土壤样品，加入90ml灭菌超纯水，混匀后进行超声处理，然后静置30～60min，获取含有微生物的上清液；超声处理条件为超声波振幅40μm，超声时间为10s，间隔5s，进行2次。6.如权利要求1所述的炭耦合复合型菌剂的制备方法，其特征在于：步骤S2中，扩散室原位培养法的过程如下：S100、配制原位培养基：取土壤采样点附近的水1L，自然pH值，加入1%(wt/vol)琼脂粉混匀，高温灭菌后降温至45℃，得到温琼脂；S200、接种和组装扩散室：将已灭菌的0.03μｍ孔径聚碳酸酯膜用密封胶与已灭菌的不锈钢垫...

【专利技术属性】
技术研发人员：李衍亮，刘美杰，邱芷莘，黄建智，李蕾，卜少腾，林金毫，王玲，余婉雪，兰善红，
申请(专利权)人：东莞理工学院，
类型：发明
国别省市：