一种基于数字微流控系统的酵母表面展示方法技术方案

本发明专利技术提供了一种基于数字微流控系统的酵母表面展示方法，通过将磁吸附模块整合到数字微流控芯片系统中，将酵母文库菌与磁珠进行结合形成复合物，再通过磁吸附系统与磁珠之间磁吸附作用，实现对酵母细胞的富集，然后通过荧光物标记抗体标记和荧光检测完成酵母表面展示。本发明专利技术基于数字微流控系统的酵母表面展示方法，将酵母表面展示的富集和筛选过程集成到数字微流控芯片上，无需使用流式细胞仪，很大程度上节约了仪器的购买和人员的培训等成本；整个流程高度集成，自动化程度高，操作相对简单；其操作周期大大缩短，提高了整体的时间效率。效率。

【技术实现步骤摘要】
一种基于数字微流控系统的酵母表面展示方法


[0001]本专利技术属于生物医学检测分析领域，具体涉及一种基于数字微流控系统的酵母表面展示方法。

技术介绍

[0002]酵母表面展示是一种蛋白真核表面展示技术。首先，把外源基因连接在特定的表面展示载体上，转化酵母细胞，诱导外源目的蛋白表达。表达的融合目的蛋白，通过与酵母细胞壁上的特定蛋白相互作用，固定在酵母细胞壁上，从而达到将外源蛋白分子展示在酵母细胞表面的目的。酵母展示技术目前可应用到多个方面，为蛋白进化，抗体筛选，抗体亲和力等方面提供了新的解决方法。
[0003]传统酵母展示技术，需要构建蛋白展示文库，通过对酵母进行诱导，将蛋白展示在酵母表面后。再通过MACS系统或磁珠法对酵母进行富集
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扩增
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富集的循环，通过若干次循环后，将目的酵母进行一定程度上的富集。随后再通过流式细胞仪对酵母细胞进行荧光分选，选出阳性克隆后进行培养。随后再对阳性克隆进行铺板，选择单克隆进行测序和检测。但是传统的酵母展示技术，由于其流程复杂，人工操作量大，及碍于酵母生长速度较慢，整体的实验周期较长，从而阻碍了对展示蛋白的筛选速率。
[0004]微流控芯片利用结构各异的微通道和形式多样的外加力场，对微量流体或样品在微观尺度上进行操纵、处理与控制，从而实现了传统实验室的部分乃至全部功能在一块微芯片上的集成。相比于传统方法，其具有成本低、分析速度快、试剂消耗少等优势，代表着未来生物、化学分析走向微型化的发展方向。然而，常规微流控芯片的局限性也是非常明显的，其需要机械泵、阀配合使用，集成化难度大，难以实现样品的连续多步处理；同时不易实现对多试剂位置和反应时间的精确控制：并且较难满足多个反应体系或者多种反应条件并行进行的高通量检测分析的应用需求。
[0005]数字微流控技术(Digital microfluidics，DMF)作为一种新兴的离散化微液滴操纵手段，则有望改变这一现状。其工作原理是利用介电湿润原理来进行液滴的操控。加在电极上的电势会改变电极的固、液表面张力，利用液滴与电极之间的接触角的不对称产生切向推力，以此来驱动液滴的移动，实现对液滴的精准操控。液滴作为数字微流控芯片中的独立单元，每个液滴都可以独立地参与不同的微反应，提高反应的通量。
[0006]相比于传统的实验处理技术，既拥有传统微流控技术样品消耗量少、高并行性的能力，同时，又不依赖微泵、微阀或微混合器等元件，不需要加工复杂的三维流体通道，具有可动态配置的优点。更为重要的是，数字微流控芯片可以实现由宏观大体积试剂到精确可控体积微纳液滴的生成，对精确控制反应条件、保证结果的精确有效性非常有利；而且，液滴的运输路径可以通过计算机程序进行逻辑控制，易于实现自动化，能够实现多通路实时可控反应，对于实现样品制备、反应、分离、检测等生化实验基本操作的完全集成化具有重要的意义。
[0007]基于此，本专利技术提供一种基于数字微流控系统的酵母表面展示方法，可以在数字
微流控芯片上实现高通量酵母表面展示。

技术实现思路

[0008]本专利技术目的在于提供一种基于数字微流控系统的酵母表面展示方法，解决的技术问题是现有的酵母表面展示系统步骤繁琐、筛选周期长的不足。
[0009]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0010]一种基于数字微流控系统的酵母表面展示方法，包括以下步骤：
[0011](1)构建特定免疫原的酵母展示文库，将酵母展示文库中的酵母菌株与生物素化后的配体蛋白、链酶亲和素磁珠进行孵育，得到含有文库酵母
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生物素化蛋白
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磁珠三者复合物的酵母文库液体；
[0012](2)将步骤(1)中含有复合物的液体注入到数字微流控系统的芯片中，在电压下，通过电极将液体分成适当体积大小的液滴；启动数字微流控平台的磁吸附模块，通过磁吸附模块与复合物中磁珠之间的磁吸附作用，将含有复合物的液滴进行固定，在电极作用下，移除不含有复合物的液滴，对复合物进行润洗，得到含复合物的液滴；
[0013](3)通过荧光物标记抗体对经过步骤(2)处理后的含复合物的液滴进行抗原定位，再分液处理得到微液滴，通过荧光检测系统筛选出含有有效阳性细胞的微液滴，加入培养基进行培养，即完成酵母表面展示。
[0014]本专利技术基于数字微流控系统的酵母表面蛋白展示方法，通过将磁吸附模块整合到数字微流控芯片系统中，将酵母文库菌与磁珠进行结合形成复合物，再通过磁吸附系统与磁珠之间磁吸附作用，实现对酵母细胞的富集，然后通过数字微流控芯片对液滴进行控制和撕裂，生成并分选出含有酵母细胞的微液滴，再通过荧光检测系统，选出阳性细胞，完成对酵母的表面展示。
[0015]本专利技术中，步骤(2)中电压为10
‑
300V。
[0016]进一步地，所述磁吸附模块的高斯值在1000
‑
6000范围。
[0017]本专利技术的一些实施方案中，通过荧光物标记抗体对经过步骤(2)处理后的含复合物的液滴进行抗原定位采用间接荧光物标记抗体，具体过程如下：在电极作用下，将一抗移动到复合物液滴中，解除磁吸附作用，重悬后，使一抗和酵母表面展示蛋白进行结合；开启数字微流控平台的磁吸附模块，通过磁吸附模块与磁珠之间的磁吸附作用，将含磁珠的复合物进行固定，在电极作用下，移动去除多余的一抗溶液；润洗复合物后，通过电极将荧光二抗移动到复合物液滴中，使荧光二抗与一抗结合；开启数字微流控平台的磁吸附模块，通过磁吸附模块与磁珠之间的磁吸附作用，将含磁珠的复合物进行固定，在电极作用下，移动去除多余的荧光二抗溶液，进行润洗。
[0018]本专利技术的一些实施方案中，通过荧光物标记抗体对经过步骤(2)处理后的含复合物的液滴进行抗原定位采用直接荧光物标记抗体，具体过程如下：在电极作用下，将荧光物标记抗体移动到含有复合物的液滴中，解除磁吸附作用，进行孵育，使荧光物标记抗体和酵母表面展示蛋白进行结合。
[0019]本专利技术可以做以下改进，在采用直接荧光物标记抗体对复合物的液滴进行抗原定位之前，对复合物液滴进行磁珠洗脱处理，具体过程如下：在电极作用下，将洗脱液移动到含复合物的液滴处，解除磁吸附作用，重悬，使抗体和配体蛋白分离。随后加入中和液对洗
脱液进行中和处理。
[0020]进一步地，所述洗脱液为酸性溶液，在重悬后加入的中和液为碱性溶液，调pH至7.0
‑
7.4。
[0021]进一步地，酸性溶液pH为2
‑
3，洗脱时间为10min以内；碱液为Tris缓冲液。
[0022]本专利技术中，润洗采用PBS缓冲液。
[0023]本专利技术中，分液处理采用微量分液技术进行。
[0024]本专利技术中，通过荧光光学系统筛选出含有有效阳性细胞的微液滴的具体过程如下：通过荧光光学系统对微液滴进行判断，若微液滴中出现荧光，则判断荧光细胞数量，若细胞数量大于一个，则回流到原有大液滴中重新等待分液，若细胞数量为一个，则本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于数字微流控系统的酵母表面展示方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建特定免疫原的酵母展示文库，将酵母展示文库中的酵母菌株与生物素化后的配体蛋白、链酶亲和素磁珠进行孵育，得到含有文库酵母
‑
生物素化蛋白
‑
磁珠三者复合物的酵母文库液体；(2)将步骤(1)中含有复合物的液体注入到数字微流控系统的芯片中，在电压下，通过电极将液体分成适当体积大小的液滴；启动数字微流控平台的磁吸附模块，通过磁吸附模块与复合物中磁珠之间的磁吸附作用，将含有复合物的液滴进行固定，在电极作用下，移除不含有复合物的液滴，对复合物进行润洗，得到含复合物的液滴；(3)通过荧光物标记抗体对经过步骤(2)处理后的含复合物的液滴进行抗原定位，再分液处理得到微液滴，通过荧光检测系统筛选出含有有效阳性细胞的微液滴，加入培养基进行培养，即完成酵母表面展示。2.根据权利要求1所述基于数字微流控系统的酵母表面展示方法，其特征在于，步骤(2)中电压为10
‑
300V。3.根据权利要求1所述基于数字微流控系统的酵母表面展示方法，其特征在于，所述磁吸附模块的高斯值在1000
‑
6000范围。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述基于数字微流控系统的酵母表面展示方法，其特征在于，通过荧光物标记抗体对经过步骤(2)处理后的含复合物的液滴进行抗原定位采用间接荧光物标记抗体，具体过程如下：在电极作用下，将一抗移动到复合物液滴中，解除磁吸附作用，重悬后，使一抗和酵母表面展示蛋白进行结合；开启数字微流控平台的磁吸附模块，通过磁吸附模块与磁珠之间的磁吸附作用，将含磁珠的复合物进行固定，在电极作用下，移动去除多余的一抗溶液；润洗复合物后，通过电极将荧光二抗移动到复...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：佛山奥素博新科技有限公司，
类型：发明
国别省市：