使用营养缺陷型可调控细胞的方法和组合物技术

本公开提供了用于生产和使用经修饰的营养缺陷型宿主细胞来改善涉及施用营养缺陷型因子的治疗的组合物和方法。因子的治疗的组合物和方法。因子的治疗的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用营养缺陷型可调控细胞的方法和组合物
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2019年5月10日递交的美国临时专利申请第62/846,073号的优先权，其通过引用整体并入本文中。序列表
[0002]本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表文件名称为1191572PCT_SEQLST.txt，创建于2020年4月27日，且大小为1,893字节。序列表的电子格式信息通过引用整体并入本文中。
专利

[0003]本文中的公开内容涉及具有改善的功效和安全性的基因治疗方法、组合物和试剂盒。背景
[0004]细胞疗法已被证明提供了有希望的治疗方法。然而，将经修饰的细胞重新引入人类宿主细胞中会带来风险，其包括免疫反应、恶性转化或转基因的过度产生或控制缺乏。
[0005]基因工程的几种方法可以控制人类细胞的功能，如细胞信号传导、增殖或细胞凋亡(参见Bonifant,Challice L.等人，Molecular Therapy
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Oncolytics 3(2016):16011；Sockolosky,Jonathan T.等人，Science359.6379(2018):1037
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1042；Tey,Siok
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Keen.Clinical&Translational Immunology 3.6(2014):e17；其中每项均在此通过引用整体并入本文中)，并使得甚至控制细胞疗法的严重副作用成为可能(Bonifant等人，2016)。尽管取得了这些进展，但由于依赖于将基因编码的控制机制引入细胞中的控制系统具有多种限制的事实(Tey,2014)，其他应用仍无法获得广泛应用，例如将工程化的多能细胞用于再生医学(参见，Ben
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David和Benvenisty,2011,Nat.Rev.Cancer 11,268
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277.；Lee等人，2013,Nat.Med.19,998
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1004；Porteus,M.(2011)Mol.Ther.19,439
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441；其中每项均在此通过引用整体并入本文中)。
[0006]可能出现的两个主要问题是“泄漏”，即在没有触发其的情况下该机制的低水平活动(参见Ando等人，(2015)Stem Cell Reports 5,597
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608,其在此通过引用整体并入本文中)，以及由于逃逸外部控制的几种机制，在机制激活后没有去除整个细胞群(参见Garin等人，(2001)Blood97,122
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129；Di Stasi等人，(2011)N Engl J Med 365,1673
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1683；Wu等人，(2014)N Engl J Med 365,1673
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1683；Yagyu等人，(2015)Mol.Ther.23,1475
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1485；其中每项均在此通过引用整体并入本文中)。例如，由病毒转导引入的转基因可以被细胞从表达中沉默(参见，等人，(2018)Switch.Int.J.Mol.Sci.19,197，其在此通过引用整体并入本文中)，或细胞可以对效应子机制发展出抗性(参见，Yagyu等人，(2015)Mol.Ther.23,1475
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1485，其在此通过引用整体并入本文中)。另一个问题是具有遗传不稳定性的细胞类型中转基因的突变，例如长时间培养的细胞系或肿瘤细胞系(Merkle等人，(2017)Nature 545,229
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233；D
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Antonio等人，(2018)Cell Rep.24,883
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894；其中每项均在此通过引用整体并入本文中)。此外，原代细胞群通常在离体培养中仅在有限的时间内保留
其功能性，并且许多类型无法通过克隆分离进行纯化。
[0007]现有的安全开关模式也有许多风险，如(1)插入到肿瘤抑制子的转基因导致细胞系的致癌转化，以及(2)插入到表观遗传沉默区域中的转基因导致缺乏表达，并因此功效，或插入后转基因随后的表观遗传沉默。基因组不稳定性是细胞致癌转化中的常见表型。此外，外源性自杀开关的点突变或遗传损失将被快速选择和放大。基于靶向细胞信号传导通路的安全开关取决于细胞的生理机能。例如，处于“前存活”模式的细胞可能会表达半胱天冬酶抑制剂，从而防止细胞在自杀开关诱导时死亡。
[0008]一种尤其有吸引力的基因疗法的应用涉及由基因产物的不足引起的或者通过基因产物(例如治疗蛋白质、抗体或RNA)的增加表达可治疗的病症的治疗。
[0009]最近的进展允许对人类细胞基因组进行精确的修饰。这种遗传工程化能够实现广泛的应用，但也需要新的方法来控制细胞行为。细胞的一种可替代控制系统是营养缺陷型，其可以通过靶向代谢中的基因进行工程化。已经针对微生物探索了该概念(参见，Steidler等人，(2003)Nat.Biotechnol.21,785
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789,其在此通过引用整体并入本文中)，并且已被酵母遗传学家广泛用作近乎通用的研究工具。如果它是通过敲除基因而不是通过引入复杂的控制机制来产生的，并且如果营养缺陷型是针对作为细胞内源性代谢一部分的无毒化合物，那么它在哺乳动物细胞中将特别强效。这可以通过破坏代谢途径中的必需基因来实现，只有当该途径的产物被外部供应并由细胞从其环境摄取时，才允许细胞发挥功能。此外，如果相应的基因也参与了细胞毒剂的激活，那么基因敲除(KO)将使细胞对这种药物产生抗性，从而使得能够消耗非修饰的细胞和纯化细胞群中的工程化细胞。几种单基因先天性代谢缺陷可以通过提供一种代谢物来治疗，并因此可以看作是人类营养缺陷型的模型。专利技术概述
[0010]本文在一些实施方案中公开了供体模板，其包含：(a)一个或多个核苷酸序列，其与营养缺陷诱导型基因座的区域同源，或与所述营养缺陷诱导型基因座的区域的互补序列同源，以及(b)编码治疗因子的转基因，其任选地与表达控制序列连接。在一些情况下，所述供体模板是单链的。在一些情况下，所述供体模板是双链的。在一些情况下，所述供体模板是质粒或DNA片段或载体。在一些情况下，所述供体模板是包含复制所必需元件的质粒，任选地包含启动子和3
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UTR。本文在一些实施方案中公开了载体，其包含：(a)一个或多个核苷酸序列，其与营养缺陷诱导型基因座的区域同源，或与所述营养缺陷诱导型基因座的区域的互补序列同源，以及(b)编码治疗因子的转基因。在一些情况下，所述载体是病毒载体。在一些情况下，所述载体选自：逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒载体。在一些情况下，所述载体还包含病毒载体复制所必需的基因。在一些情况下，所述转基因的两侧均侧接有与所述营养缺陷诱导型基因座的区域或其互补序列同源的核苷酸序列。在一些情况下，所述营养缺陷诱导型基因座是编码参与营养缺陷型因子的合成、再循环或补救的蛋白质的基因。在一些本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.供体模板，其包含：(a)一个或多个核苷酸序列，其与营养缺陷诱导型基因座的区域同源，或与所述营养缺陷诱导型基因座的区域的互补序列同源，以及(b)编码治疗因子的转基因，其任选地与表达控制序列连接。2.如权利要求1所述的供体模板，其中所述供体模板是单链的。3.如权利要求1所述的供体模板，其中所述供体模板是双链的。4.如权利要求1所述的供体模板，其中所述供体模板是质粒或DNA片段或载体。5.如权利要求4所述的供体模板，其中所述供体模板是包含复制所必需的元件，任选地包含启动子和3
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UTR的质粒。6.载体，其包含：(a)一个或多个核苷酸序列，其与营养缺陷诱导型基因座的区域同源，或与所述营养缺陷诱导型基因座的区域的互补序列同源，以及(b)编码治疗因子的转基因。7.如权利要求6所述的载体，其中所述载体是病毒载体。8.如权利要求7所述的载体，其中所述载体选自：逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体。9.如权利要求7所述的载体，其还包含所述病毒载体复制所必需的基因。10.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述转基因的两侧均侧接有与所述营养缺陷诱导型基因座的区域或其互补序列同源的核苷酸序列。11.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述营养缺陷诱导型基因座是编码参与营养缺陷型因子的合成、再循环或补救的蛋白质的基因。12.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述营养缺陷诱导型基因座位于表1中的基因内，或位于控制表1中基因表达的区域内。13.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述营养缺陷诱导型基因座位于编码尿苷单磷酸合成酶(UMPS)的基因内。14.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述营养缺陷诱导型基因座位于编码羧化全酶合成酶的基因内。15.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中与所述营养缺陷诱导型基因座的区域同源的所述核苷酸序列与所述营养缺陷诱导型基因座的至少200个连续的核苷酸具有98％的同一性。16.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中与所述营养缺陷诱导型基因座的区域同源的所述核苷酸序列与人尿苷单磷酸合成酶或羧化全酶合成酶或表1中的任一基因的至少200个连续的核苷酸具有98％的同一性。17.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其还包含与所述转基因可操作地连接的表达控制序列。18.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是组织特异性表达控制序列。19.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是启动子或增强子。20.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是诱导型启动子。
21.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是组成型启动子。22.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是转录后调控序列。23.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是微小RNA。24.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其还包含标志物基因。25.如权利要求24所述的供体模板或载体，其中所述标志物基因包括至少NGFR或EGFR的片段、至少CD20或CD19的片段、Myc、HA、FLAG、GFP或抗生素抗性基因。26.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述转基因编码选自以下的蛋白质：激素、细胞因子、趋化因子、干扰素、白介素、白介素结合蛋白、酶、抗体、Fc融合蛋白、生长因子、转录因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白、受体、细胞表面抗原、受体拮抗剂和共刺激因子、结构蛋白、细胞表面抗原、离子通道、表观遗传修饰子和RNA编辑蛋白。27.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述转基因编码T细胞抗原受体。28.如权利要求1
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25中任一项所述的供体模板或载体，其中所述转基因编码RNA，任选地编码调控性微小RNA。29.用于将转基因靶向整合至营养缺陷诱导型基因座的核酸酶系统，其包含：(a)Cas9蛋白，和(b)特异性针对营养缺陷诱导型基因座的向导RNA。30.用于将转基因靶向整合至营养缺陷诱导型基因座的核酸酶系统，其包含：特异性针对所述营养缺陷诱导型基因座的大范围核酸酶。31.如权利要求30所述的核酸酶系统，其中所述大范围核酸酶是ZFN或TALEN。32.如权利要求29
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31中任一项所述的核酸酶系统，其还包含权利要求1
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28中任一项所述的供体模板或载体。33.离体的经修饰的宿主细胞，其包含：编码整合在营养缺陷诱导型基因座处的治疗因子的转基因，其中所述经修饰的宿主细胞是营养缺陷型因子营养缺陷型的，并且能够表达所述治疗因子。34.如权利要求33所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞是哺乳动物细胞。35.如权利要求33所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞是人类细胞。36.如权利要求33所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞选自：胚胎干细胞、干细胞、祖细胞、多能干细胞、诱导型多能干(iPS)细胞、成体干细胞、分化的细胞、间充质干细胞、神经干细胞、造血干细胞或造血祖细胞、脂肪干细胞、角化细胞、骨骼干细胞、肌肉干细胞、成纤维细胞、NK细胞、B细胞、T细胞和外周血单个核细胞(PBMC)。37.如权利要求33所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞来源于来自用所述经修饰的宿主细胞或其群体治疗的对象的细胞。38.产生经修饰的哺乳动物宿主细胞的方法，包括：(a)向所述哺乳动物宿主细胞中引入靶向并切割营养缺陷诱导型基因座处的DNA的至少第一核酸酶系统，或编码所述至少一种核酸酶系统的一个或多个组件的核酸；和(b)向所述哺乳动物宿主细胞中引入权利要求1
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28中任一项所述的供体模板或载体。39.如权利要求38所述的方法，其还包括引入靶向并切割第二基因组基因座处的DNA的
第二核酸酶系统，或编码所述第二核酸酶系统的一个或多个组件的核酸，以及任选地第二供体模板或载体。40.将转基因靶向整合至离体哺乳动物细胞中营养缺陷诱导型基因座的方法，其包括：使所述哺乳动物细胞与权利要求1
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28中任一项所述的供体模板或载体，以及核酸酶接触。41.如权利要求38
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40中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是ZFN。42.如权利要求38
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40中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是TALEN。43.产生经修饰的哺乳动物宿主细胞的方法，其包括：(a)向所述哺乳动物宿主细胞中引入(i)Cas9多肽，或编码所述Cas9多肽的核酸；(ii)特异性针对营养缺陷诱导型基因座的向导RNA，或编码所述向导RNA的核酸；和(iii)权利要求1
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28中任一项所述的供体模板或载体。44.如权利要求42所述的方法，其还包括：(b)向所述哺乳动物宿主细胞中引入(i)特异性针对第二营养缺陷诱导型基因座的第二向导RNA，或编码所述向导RNA的核酸，和任选地(ii)第二供体模板或载体。45.将转基因靶向整合至离体哺乳动物细胞中营养缺陷诱导型基因座的方法，其包括：使所述哺乳动物细胞与权利要求1
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28中任一项所述的供体模板或载体、Cas9多肽和向导RNA接触。46.如权利要求43
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45中任一项所述的方法，其中所述向导RNA是嵌合RNA。47.如权利要求43
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45中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包含两个杂交的RNA。48.如权利要求38
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45中任一项所述的方法，其还包括在所述营养缺陷诱导型基因座中产生一个或多个单链断裂。49.如权利要求38
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45中任一项所述的方法，其还包括在所述营养缺陷诱导型基因座中产生双链断裂。50.如权利要求38
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49中任一项所述的方法，其中所述营养缺陷诱导型基因座使用所述供体模板或载体通过同源重组进行修饰。51.如权利要求38
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50中任一项所述的方法，其还包括将所述经修饰的哺乳动物宿主细胞或离体的哺乳动物细胞扩增成经修饰的哺乳动物宿主细胞群或离体的哺乳动物细胞群，以及任选地培养所述细胞或其群体。52.如权利要求51所述的方法，其还包括选择包含整合到所述营养缺陷诱导型基因座中的转基因的细胞或其群体。53.如权利要求52所述的方法，其中所述选择包括：(i)选择需要所述营养缺陷型因子以发挥功能的细胞或其群体；以及任选地(ii)选择包含整合到所述营养缺陷诱导型基因座中的转基因的细胞或其群体。54.如权利要求52所述的方法，其中所述营养缺陷诱导型基因座是编码尿苷单磷酸合成酶的基因，并且通过与5
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FOA接触来选择所述细胞或其群体。55.无菌组合物，其包含权利要求1
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28中任一项所述的供体模板或载体，或权利要求29
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32中任一项所述的核酸酶系统，以及无菌水或药学上可接受的赋形剂。56.无菌组合物，其包含：权利要求33
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37中任一项所述的经修饰的宿主细胞，和无菌水或药学上可接受的赋形剂。57.试剂盒，其包含前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体或核酸酶系统或经
修饰的宿主细胞，或以上的组合，任选地带有容器或小瓶。58.在对象中表达治疗因子的方法，其包括：(a)施用权利要求33
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37中任一项所述的经修饰的宿主细胞；(b)任选地施用条件化方案以允许所述经修饰的宿主细胞移植；和(c)施用所述营养缺陷型因子。59.如权利要求58所述的方法，其中施用所述经修饰的宿主细胞和营养缺陷型因子同时进行。60.如权利要求58所述的方法，其中施用所述经修饰的宿主细胞和营养缺陷型因子依序进行。61.如权利要求58所述的方法，其还包括在足以促进所述治疗因子表达的一段时间内定期持续施用所述营养缺陷型因子。62.如权利要求58所述的方法，其还包括降低所述营养缺陷型因子的施用速率，以降低所述治疗因子的表达。63.如权利要求58所述的方法，其还包括增加所述营养缺陷型因子的施用，以增加所述治疗因子的表达。64.如权利要求58所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯，
申请(专利权)人：莱兰斯坦福初级大学评议会，
类型：发明
国别省市：