一种用于Ⅰ亚群禽腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于Ⅰ亚群禽腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。本发明专利技术提供了的成套引物和探针，其由引物1、引物2和探针组成；所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列2；所述探针的核苷酸序列为序列表中序列3。本发明专利技术提供了引物探针组及其试剂盒，该试剂盒可以用于Ⅰ亚群禽腺病毒的通用检测，其中包括检测Ⅰ亚群中的A、B、C、D、E共5个种，1

【技术实现步骤摘要】
一种用于Ⅰ亚群禽腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒


[0001]本专利技术属于兽医领域，具体属于动物疾病诊断和病原检测，涉及一种用于Ⅰ亚群禽腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。

技术介绍

[0002]禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)是禽类常见的传染性病原，在世界范围内的鸡、鸭、鹅中感染普遍。大部分Fadv是禽体内的条件性病原体，在健康动物体内复制而不致病或只引起轻微的临床症状。但当动物受到应激或与其他免疫抑制性疾病共同发生时，腺病毒致病性会显著增强。禽腺病毒属于腺病毒科（Adenoviridae）、禽腺病毒属（Aviadenovirus），根据其群特异性抗原不同可分为3个群，即：FAdV
‑Ⅰ
、FAdV
‑Ⅱ
和FAdV
‑Ⅲ
。其中Ⅰ亚群FAdV(FAdV
‑Ⅰ
)是从鸡、鹅和鸭的呼吸道感染分离得到的，有5个种共12个血清型，即FAdV
‑
1～FAdV
‑
8a、FAdV
‑
8b～FAdV
‑
11。临床上主要表现为心包积液综合征（hydropericardium syndrome，HPS）、包涵体肝炎（inclusion body hepatitis，IBH）、肌胃糜烂（gizzard erosions， GE）和产蛋下降等症状，该病毒既可水平传播，又可垂直传播。2015年以来，我国的山东、河南、江苏、安徽和湖南等多个省份暴发了FAdV
‑Ⅰ
病原感染，该病主要侵害3～5周龄肉鸡和蛋雏鸡，感染率高达90% 以上，死亡率20%～80%，对养殖业造成巨大损失。目前，该病主要根据临床表现和病理剖检可做出初步诊断，应用病毒分离测序、病理组织学观察、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验（ELISA），聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量作出确诊，但现有的检测方法存在一定的局限性及非特异性。
[0003]目前我国的Fadv
‑Ⅰ
亚群主要流行毒株为4型、8a型、8b型、10型和11型，各血清型常呈交叉感染。

技术实现思路

[0004]本专利技术一个目的是提供一种用于Ⅰ亚群禽腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。
[0005]本专利技术提供的成套引物和探针，其由引物1、引物2和探针组成；所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列2；所述探针的核苷酸序列为序列表中序列3。
[0006]上述成套引物和探针中，所述探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团，在本专利技术的实施例中，探针的两端分别标记荧光基团FAM和淬灭基团BHQ
‑
1。
[0007]上述成套引物和探针中，所述引物1、所述引物2和所述探针的配比为1
‑
18：1
‑
18：1
‑
5。
[0008]本专利技术另一个目的是提供一种PCR试剂。
[0009]本专利技术提供的PCR试剂，其包括上述成套引物和探针。
[0010]上述PCR试剂中，所述引物1、所述引物2和所述探针在所述PCR试剂中的浓度分别为50
‑
900nM、50
‑
900nM和50
‑
250nM。
[0011]上述试剂中，还包括DNA聚合酶和PCR反应缓冲液(含dNTPs和Mg
2+
)。
[0012]上述PCR试剂中包含的DNA聚合酶可以为抗体修饰的热启动DNA聚合酶和Taq DNA 聚合酶中的一种或者两种混合。
[0013]上述PCR反应缓冲液中包含的缓冲体系可以是Tris、甘氨酸
‑
NaOH、Tricine中的一种。
[0014]上述PCR反应缓冲液中二价阳离子可以是Mg2+、Mn2+中的一种或者几种混合。
[0015]上述PCR反应缓冲液中的一价阳离子可以是K+、NH4+、Na+、Li+中的一种或者几种混合。
[0016]上述PCR反应缓冲液中的dNTPs包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
[0017]上述PCR反应缓冲液中的PCR反应增强剂可以是甜菜碱、海藻糖、DMSO、明胶、甘油、SSB、sso7d、BSA中的一种或者几种混合。
[0018]本专利技术还有一个目的是提供一种试剂盒。
[0019]本专利技术提供的试剂盒，包括上述成套引物和探针或上述的PCR试剂。
[0020]上述试剂盒还可以包括阳性对照，阳性对照可为Ⅰ亚群禽腺病毒病毒或其DNA、含有Ⅰ亚群禽腺病毒Hexon基因的质粒（在本专利技术的实施例中如序列4所示的质粒）或含有Ⅰ亚群禽腺病毒基因片段的DNA等。
[0021]所述试剂盒还可包括阴性对照，可为去离子水等。
[0022]上述成套引物和探针或上述的PCR试剂在如下1）
‑
3）中至少一种或者具有如下1）
‑
3）中至少一种功能的试剂盒中的应用也是本专利技术保护的范围；1）鉴定或辅助鉴定Ⅰ亚群禽腺病毒；2）检测或辅助检测待测病毒是否为Ⅰ亚群禽腺病毒；3）检测或辅助检测待测样本是否含有Ⅰ亚群禽腺病毒或Ⅰ亚群禽腺病毒核酸。
[0023]上述Ⅰ亚群禽腺病毒为Ⅰ亚群禽腺病毒12个血清型中任一种；Ⅰ亚群禽腺病毒12个血清型包括Ⅰ亚群中的A、B、C、D、E共5个种，具体为：FAdV
‑
1～FAdV
‑
8a、FAdV
‑
8b～FAdV
‑
11。
[0024]上述试剂盒在如下1）
‑
3）中至少一种或者具有如下1）
‑
3）中至少一种功能的产品中的应用也是本专利技术保护的范围；1）鉴定或辅助鉴定Ⅰ亚群禽腺病毒；2）检测或辅助检测待测病毒是否为Ⅰ亚群禽腺病毒；3）检测或辅助检测待测样本是否含有Ⅰ亚群禽腺病毒或Ⅰ亚群禽腺病毒核酸。
[0025]上述Ⅰ亚群禽腺病毒为Ⅰ亚群禽腺病毒12个血清型中任一种。
[0026]上述应用中，所述待测样本为离体全血、血清、血浆、肝脏、心脏、肾脏或泄殖腔拭子等。
[0027]本专利技术还有一个目的是提供如下方法。
[0028]本专利技术提供的一种检测或辅助检测待测病毒是否为Ⅰ亚群禽腺病毒的方法，包括如下步骤：用上述PCR试剂对待测病毒进行荧光定量PCR，检测扩增产物，若所述扩增产物的Ct值≤38.5且扩增产物呈S曲线，则所述待测病毒为或候选为Ⅰ亚群禽腺病毒，若所述扩增产物的Ct值>38.5或所述扩增产物不呈S曲线，则所述待测病毒不为或候选不为Ⅰ亚群禽腺病毒。
[0029]或，本专利技术提供了一种检测或辅助检测待测样本是否含有Ⅰ亚群禽腺病毒的方法，
包括如下步骤：用上述PCR试剂对待测样本进行荧光定量PCR，检测扩增产物，若所述扩增产物的Ct值≤38.5且扩增产物呈S曲线，则所述待测样本中含有或候选含有Ⅰ亚群禽腺病毒，若所述扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.成套引物和探针，其由引物1、引物2和探针组成；所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列2；所述探针的核苷酸序列为序列表中序列3。2.根据权利要求1所述的成套引物和探针，其特征在于：所述探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团；或所述引物1、所述引物2和所述探针的配比为1
‑
18：1
‑
18：1
‑
5。3.一种PCR试剂，其特征在于：所述PCR试剂包括权利要求1或2中的成套引物和探针。4.根据权利要求3所述的PCR试剂，其特征在于：所述引物1、所述引物2和所述探针在所述PCR试剂中的浓度分别为50
‑
900nM、50
‑
900nM和50
‑
250nM。5.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1或2所述成套引物和探针或权利要求3或4所述的PCR试剂。6.权利要求1或2所述成套引物和探针或权利要求3或4所述的PCR试剂在如下1）
‑
3）中至少一种或者具有如下1）
‑
3）中至少一种功能的试剂盒中的应用，1）鉴定或辅助鉴定Ⅰ亚群禽腺病毒；2）检测或辅助检测待测病毒是否为Ⅰ亚群禽腺病毒；3）检测或辅助检测待测样本是否含有Ⅰ亚群...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟新涛，刘铭，韩典霖，
申请(专利权)人：济凡生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：