检测猪捷申病毒环介导等温扩增引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测猪捷申病毒(porcine tescho virus，PTV)环介导等温扩增引物组及试剂盒。本发明专利技术根据PTV保守基因组序列设计了1对外引物F3和B3，1对内引物FIP和BIP，所述的引物组中各引物序列如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
检测猪捷申病毒环介导等温扩增引物组及试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种检测猪捷申病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒，属于动物传染病学检测


技术介绍

[0002]猪捷申病毒(porcine tescho virus，PTV)属于小RNA病毒科的捷申病毒属，会引起一种接触性的病毒性传染病，即猪捷申病(Teschen disease)。该病毒会导致猪出现脑脊髓灰质炎、母猪繁殖障碍、腹泻、心包炎、心肌炎、皮肤损伤和肺炎等症状。猪捷申病分布的地理区域比较广泛，目前，在世界各地都有报道猪捷申病，猪捷申病已经成为世界范围的猪传染病之一，影响世界养猪业的正常生产，猪捷申病的调查、诊断、预防和疫苗研发等相关研究值得广大研究者关注。
[0003]已发现的家猪PTV血清型分别为PTV
‑
1～PTV
‑
12共12个血清型，在野猪中检出PTV
‑
13，故目前共有13种血清型毒株。不同血清型毒株在基因序列存在差异，13个血清型毒株可形成各自的进化树分支。据报道，不同血清毒株的毒力也存在差异，导致的临床症状也不同。PTV
‑
1的强毒株可导致严重的捷申病毒脑脊髓灰质炎，被世界动物卫生组织(OIE)列为B类传染病，PTV
‑
1的其他弱毒株及其他血清型能引起温和型或隐性感染。
[0004]猪是PTV的唯一宿主，不同品种不同日龄猪只均可感染，其中血清抗体阴性猪较为易感，幼龄猪的易感性最高。PTV病具有地方流行性，隐性感染猪、病猪和康复猪为主要传染源，该病毒在猪群的感染呈波浪式。带毒猪通过排泄物持续散毒，污染饮水和饲料导致其它各个年龄段猪群经消化道、呼吸道等途径感染。未妊娠母猪感染后，带毒期可达2个月，妊娠母猪带毒期约为3个月，可通过胎盘感染胎儿。公猪精液可带毒，但无证据表明精液中携带病毒可感染母猪。
[0005]对PTV的流行病学调查研究说明PTV在我国分布广泛，但分布具有地域差异性，各个地区流行的血清型不同。虽然PTV未对我国养猪业造成严重影响，相关研究学者以及研究报道较少，但应对其潜伏感染引起高度重视，一旦PTV出现爆发性流行，将对我国养猪业造成严重损失。
[0006]环介导的等温扩增(LAMP)是一种较新的核酸扩增方法，能在等温条件下扩增DNA，具有快速、高效、特异性强等特点。这种方法依赖于BstDNA聚合酶大片段进行的自动循环链置换DNA合成。LAMP方法最大的优点是能够在60℃
‑
65℃的恒温条件下，在1h或更短的时间内扩增出特异性和灵敏度高的特异性靶DNA序列，而且不需要热循环仪或专门的实验室设施。本方法的较高扩增效率使得使用插入染料(如紫外光照射的SYBR Green I或琼脂糖凝胶电泳后的数字成像)可以简单地观察到扩增。因此，LAMP方法已被开发用于检测多种病毒。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的在于提供一种检测PTV的环介导等温扩增引物组及其试剂盒。本专利技术
的提出为检测猪内脏组织和粪样的PTV提供了一种实用而经济的替代方法，甚至可以在野外使用。
[0008]本专利技术目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009]本专利技术的一种检测猪捷申病毒(porcine tescho virus，PTV)的环介导等温扩增引物组，所述的引物组由1对外引物F3和B3和1对内引物FIP和BIP组成，所述的引物组中各引物序列如下：
[0010]F3:TGGGACTGCATTGCATAT
[0011]B3:GGCCCTTATCTTTGCGTT
[0012]FIP:GCATTCCCATACAGGAACTCCACCCTAGGCACCTATTGAGA
[0013]BIP:GGCTGGCCGTCTGTACTTTGCAGAGAGAAAATTTTCAAACATG。
[0014]进一步的，本专利技术还提出了所述的引物组在制备检测猪捷申病毒的试剂中的用途。
[0015]其中，优选的，所述的试剂为用于环介导等温扩增检测的试剂。
[0016]再进一步的，本专利技术还提出了一种检测猪捷申病毒的环介导等温扩增试剂盒，其中含有以上所述的引物组。
[0017]其中，优选的，所述试剂盒还包括：荧光目视检测试剂、10
×
反应缓冲液、BstDNA聚合酶、10mM dNTP mix、betaine、MgSO4、超纯水。
[0018]其中，优选的，用于检测猪捷申病毒时，环介导等温扩增的反应体系为25μL，包括：5pmol F3和B3各1μL，40pmol FIP和BIP各1μL，10
×
反应缓冲液2.5μL，8U/μLBstDNA聚合酶1μL，5.0M betaine 4μL，30mM MgSO45μL，10mM dNTPmix 2.5μL，待检样品cDNA模板2μL，其余用无核酸酶超纯水补足至25μL。
[0019]其中，优选的，用于检测猪捷申病毒时，环介导等温扩增的反应条件为63℃反应60min。
[0020]本专利技术还提供了所述的试剂盒在制备检测或诊断猪捷申病毒试剂中的用途。
[0021]本专利技术还提供了所述的环介导等温扩增反应的引物组在制备PTV快速诊断试剂中的用途。
[0022]本专利技术具有以下优点和效果：
[0023]1、污染小，结果直观：本专利技术试剂盒的荧光目视试剂(FD)在反应前加入，污染小。其含有的钙黄绿素起初与锰离子结合而处于荧光粹灭状态。但是随着LAMP反应的进行，被反应副产物中的焦磷酸根离子夺去结合的锰离子，钙黄绿素恢复游离态从而发出荧光，并进而与反应液中的镁离子相结合，使荧光信号得到增强。
[0024]2、操作简便、快速：本专利技术建立的PTV LAMP方法操作简便、无需复杂昂贵仪器。此外，建立的PTV LAMP方法快速高效，从提取样品到结果判定可在60min内完成(时效性和TaqMan实时荧光定量PCR方法相当)。反应结果判定方法简单，LAMP反应的扩增产物用SYBR Green I染色，在紫外光照射下肉眼可检测到扩增产物。
[0025]3、灵敏度高：本专利技术通过用10倍连续稀释细胞培养中的PTVRNA的方法确定了LAMP的检测限。本专利技术的PTV LAMP对PTV的检测下限与其他虫媒病毒相似：可检测到2.86copy/μL的PTV RNA。
[0026]4、特异性强：本专利技术的PTV LAMP方法特异性好，用PRV，GETV，PRRSV，PCV，CSFV和
JEV的RNA进行PTV LAMP检测，未发现阳性结果。
附图说明
[0027]图1为PTV的环介导等温扩增方法建立的琼脂糖凝胶电泳结果；
[0028]图2为RT
‑
LAMP检测PTV温度的优化；
[0029]其中，1
‑
6泳道：分别对应于65℃、64℃、63℃、62℃、61℃和60℃。M泳道：DNA标记；7泳道：阴性对照；
[0030本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测猪捷申病毒(porcine tescho virus，PTV)的环介导等温扩增引物组，其特征在于：所述的引物组由1对外引物F3和B3和1对内引物FIP和BIP组成，所述的引物组中各引物序列如下：F3:TGGGACTGCATTGCATATB3:GGCCCTTATCTTTGCGTTFIP:GCATTCCCATACAGGAACTCCACCCTAGGCACCTATTGAGABIP:GGCTGGCCGTCTGTACTTTGCAGAGAGAAAATTTTCAAACATG。2.权利要求1所述的引物组在制备检测猪捷申病毒的试剂中的用途。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的试剂为用于环介导等温扩增检测的试剂。4.一种检测猪捷申病毒的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：荧光目视检测试剂、10
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘昊，梁晓彤，李丽霞，黄良宗，刘明杰，陈盛楠，
申请(专利权)人：广东方道基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：