【技术实现步骤摘要】
核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针及其制备方法、试剂盒与检测方法
[0001]本专利技术属于马铃薯病毒检测
，尤其涉及核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针及其制备方法、试剂盒与检测方法。
技术介绍
[0002]马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato Spimdle Tuber Viroid，简称PSTVd)，是引起马铃薯纺锤块茎病的原因，属于世界性检疫病害，易感染，易传播。据报道，PSTVd强系可使马铃薯减产达60％，弱系减产约20～35％，常造成较大的经济损失。PSTVd不能通过茎尖剥离、组织培养脱毒，必须通过严格的马铃薯种薯检疫预防和控制其传播。
[0003]目前，PSTVd的检测方法主要为RT
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PCR技术及核酸斑点杂交技术，RT
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PCR对实验条件及技术要求高，普及程度不高。而核酸斑点杂交法具有操作简单易掌握、检测灵敏度高的优点，更易于推广。但现阶段应用的核酸斑点杂交法所使用的探针产量低、成本高，约20μL探针的试剂成本即1600元。受探针成本高昂的影响，每次检测探针用量极...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种权利要求1所述核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针的制备方法，其特征在于，以PSTVd反转录得到的cDNA为模板，以正向引物PSTVd
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F和反向引物PSTVd
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R为引物组进行非对称PCR扩增，所得209bp扩增产物即为检测PSTVd的探针；所述正向引物PSTVd
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F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述反向引物PSTVd
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R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述反向引物PSTVd
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R的5
’
端标记地高辛或生物素。3.根据权利要求2所述一种核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针的制备方法，其特征在于，所述非对称PCR扩增的反应体系为：PSTVd阳性样品DNA 1.0μl，浓度为10uM的正向引物PSTVd
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F 0.1μl、浓度为10uM的反向引物PSTVd
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R 0.5μl，10
×
PCR Buffer 2.5μl，浓度为2.5mM的dNTP Mixture 2.0μl，浓度为5U/μl的Taq酶0.3μl和ddH2O 17.2μl；所述非对称PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃终延伸7min，4℃保温。4.一种核酸斑点杂交法检测PSTVd的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针。5.根据权利要求4所述一种核酸斑点杂交法检测PSTVd的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取缓冲液、氯仿、杂交液、洗液I、洗液II、洗涤缓冲液、阻断液、抗体液、检测缓冲液、显色反应缓冲液、NBT、BCIP和正电荷尼龙膜方格。6.根据权利要求5所述一种核酸斑点杂交法检测PSTVd的试剂盒，其特征在于，所述抗体液含有抗地高辛碱性磷酸酶复合物或链霉亲和素
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碱性磷酸酶复合物。7.一种核酸斑点杂交法检测PSTVd的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、提取、固定核酸：取马铃薯样品按质量体积比与提取缓冲液混合、研磨，将研磨所得混合体系置于37℃条件下完成孵育，加入氯仿旋涡震荡使其充分混合，离心所得上清液即为核酸溶液，取所得核酸溶液点样于正电荷尼龙膜的方格中，室温干燥后进行紫外交联固定核酸；步骤二、杂交：杂交液预热熔化后加入权利要求1所述检测PSTVd的探针，混匀后将步骤一完成核酸固定的正电荷尼龙膜置于杂交液中，杂交过夜；取出完成杂交的正电荷尼龙膜，依次用洗液I、洗液II和洗涤缓冲液进行洗涤；步骤三、阻断显色：配制1
×
阻断液和抗体液，将步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：白艳菊，王腾，张威，刘尚武，黄元炬，马爽，
申请(专利权)人：黑龙江省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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