【技术实现步骤摘要】
核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针及其制备方法、试剂盒与检测方法
[0001]本专利技术属于马铃薯病毒检测
，尤其涉及核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针及其制备方法、试剂盒与检测方法。
技术介绍
[0002]马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato Spimdle Tuber Viroid，简称PSTVd)，是引起马铃薯纺锤块茎病的原因，属于世界性检疫病害，易感染，易传播。据报道，PSTVd强系可使马铃薯减产达60％，弱系减产约20～35％，常造成较大的经济损失。PSTVd不能通过茎尖剥离、组织培养脱毒，必须通过严格的马铃薯种薯检疫预防和控制其传播。
[0003]目前，PSTVd的检测方法主要为RT
‑
PCR技术及核酸斑点杂交技术，RT
‑
PCR对实验条件及技术要求高，普及程度不高。而核酸斑点杂交法具有操作简单易掌握、检测灵敏度高的优点，更易于推广。但现阶段应用的核酸斑点杂交法所使用的探针产量低、成本高，约20μL探针的试剂成本即1600元。受探针成本高昂的影响，每次检测探针用量极少，约1μL探针用于检测100个反应，杂交反应池中探针浓度低直接导致检测灵敏度的降低。
[0004]申请号为200910073290.1的申请文件公开了一种PSTVd双体cDNA探针，该探针制备过程需经过2次酶切并与质粒连接，制成具有PSTVd双体探针序列的载体，并以包含双体探针序列的载体为模板通过PCR扩增双体探针，在扩增过程中将探针中的碱基“T”替换为被标记的Dig
‑>dUTP。该方法虽然提高了检测的灵敏度，但双体探针制备过程复杂，探针产量低，成本高。且其探针中含有dUTP，其易被RNA酶降解，需长期保存在
‑
20℃以下，对保存条件要求较高，存在应用场景不灵活的缺点。
[0005]申请号为201310642994.2的申请文件公开了一种PSTVd液相芯片检测方法，其探针应用方式是将探针固定于微球上，利用一对带标记物的引物对PSTVd阳性样品进行扩增，使扩增产物上标记上生物素，然后使扩增产物与探针发生杂交，最终通过检测微球上是否发生荧光反应进行检测PSTVd的有无。该方法检测过程需要对待测样本进行PCR扩增，对检测设备要求高，检测程序复杂。
技术实现思路
[0006]为解决现有核酸斑点杂交法检测PSTVd使用的探针成本高、检测程序复杂的问题，本专利技术提供了核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针及其制备方法、试剂盒与检测方法。
[0007]本专利技术的技术方案：
[0008]一种核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0009]一种本专利技术所述核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针的制备方法，以PSTVd反转录得到的cDNA为模板，以正向引物PSTVd
‑
F和反向引物PSTVd
‑
R为引物组进行非对称PCR扩增，所得209bp扩增产物即为检测PSTVd的探针；
[0010]所述正向引物PSTVd
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0011]所述反向引物PSTVd
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述反向引物PSTVd
‑
R的5
’
端标记地高辛或生物素。
[0012]进一步的，所述非对称PCR扩增的反应体系为：PSTVd阳性样品DNA 1.0μl，浓度为10uM的正向引物PSTVd
‑
F 0.1μl、浓度为10uM的反向引物PSTVd
‑
R 0.5μl，10
×
PCR Buffer 2.5μl，浓度为2.5mM的dNTP Mixture 2.0μl，浓度为5U/μl的Taq酶0.3μl和ddH2O 17.2μl；
[0013]所述非对称PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃终延伸7min，4℃保温。
[0014]一种核酸斑点杂交法检测PSTVd的试剂盒，包括本专利技术所述的核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针。
[0015]进一步的，还包括核酸提取缓冲液、氯仿、杂交液、洗液I、洗液II、洗涤缓冲液、阻断液、抗体液、检测缓冲液、显色反应缓冲液、NBT、BCIP和正电荷尼龙膜方格。
[0016]进一步的，所述抗体液含有抗地高辛碱性磷酸酶复合物或链霉亲和素
‑
碱性磷酸酶复合物。
[0017]一种核酸斑点杂交法检测PSTVd的方法，包括如下步骤：
[0018]步骤一、提取、固定核酸：
[0019]取马铃薯样品按质量体积比与提取缓冲液混合、研磨，将研磨所得混合体系置于37℃条件下完成孵育，加入氯仿旋涡震荡使其充分混合，离心所得上清液即为核酸溶液，取所得核酸溶液点样于正电荷尼龙膜的方格中，室温干燥后进行紫外交联固定核酸；
[0020]步骤二、杂交：
[0021]杂交液预热熔化后加入本专利技术所述检测PSTVd的探针，混匀后将步骤一完成核酸固定的正电荷尼龙膜置于杂交液中，杂交过夜；取出完成杂交的正电荷尼龙膜，依次用洗液I、洗液II和洗涤缓冲液进行洗涤；
[0022]步骤三、阻断显色：
[0023]配制1
×
阻断液和抗体液，将步骤二洗涤后的正电荷尼龙膜依次置于1
×
阻断液和抗体液中进行孵育；将完成孵育的正电荷尼龙膜置于洗涤缓冲液中洗涤，再置于检测缓冲液中平衡，将显色反应缓冲液、NBT和BCIP混匀后均匀涂在正电荷尼龙膜上，避光孵育显色，出现显色则表明待测马铃薯样本中存在PSTVd，显色越深则PSTVd阳性样本浓度越高。
[0024]进一步的，步骤一所述马铃薯样品与提取缓冲液的质量体积比为0.1g:150μl，所述提取缓冲液含有如下浓度的组分：1M NaCl、20mM MgCl2、0.5M醋酸钠和3％SDS；所述37℃孵育的时间为15min；所述离心为1000rpm离心10min；所述点样为2μl核酸溶液点样于正电荷尼龙膜上的一个方格中；所述紫外交联固定是在1200J条件下，将正电荷尼龙膜的正反面各交联1min。
[0025]进一步的，步骤二所述杂交液的预热温度为68℃；所述检测PSTVd的探针与杂交液的体积比为10μl:5ml；所述杂交过夜的条件为68℃，8～15rpm；所述洗液I含有如下浓度的组分：2
×
SSC，0.1％SDS，所述洗液I洗涤是用20ml洗液I在室温下洗涤2次，每次15min；所述洗液II含有如下浓度的组分：1
×
SSC，0.1％SDS，所述洗液II洗涤是用20ml 50℃预热的洗液II在55℃下洗涤2次，每次15min；所述洗涤缓冲液含有如下浓度的组分：0.1M马来酸，0.3％Tween
‑
20，所述洗涤缓冲液洗涤本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种权利要求1所述核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针的制备方法，其特征在于，以PSTVd反转录得到的cDNA为模板，以正向引物PSTVd
‑
F和反向引物PSTVd
‑
R为引物组进行非对称PCR扩增，所得209bp扩增产物即为检测PSTVd的探针；所述正向引物PSTVd
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述反向引物PSTVd
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述反向引物PSTVd
‑
R的5
’
端标记地高辛或生物素。3.根据权利要求2所述一种核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针的制备方法，其特征在于，所述非对称PCR扩增的反应体系为：PSTVd阳性样品DNA 1.0μl，浓度为10uM的正向引物PSTVd
‑
F 0.1μl、浓度为10uM的反向引物PSTVd
‑
R 0.5μl，10
×
PCR Buffer 2.5μl，浓度为2.5mM的dNTP Mixture 2.0μl，浓度为5U/μl的Taq酶0.3μl和ddH2O 17.2μl；所述非对称PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃终延伸7min，4℃保温。4.一种核酸斑点杂交法检测PSTVd的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针。5.根据权利要求4所述一种核酸斑点杂交法检测PSTVd的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取缓冲液、氯仿、杂交液、洗液I、洗液II、洗涤缓冲液、阻断液、抗体液、检测缓冲液、显色反应缓冲液、NBT、BCIP和正电荷尼龙膜方格。6.根据权利要求5所述一种核酸斑点杂交法检测PSTVd的试剂盒，其特征在于，所述抗体液含有抗地高辛碱性磷酸酶复合物或链霉亲和素
‑
碱性磷酸酶复合物。7.一种核酸斑点杂交法检测PSTVd的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、提取、固定核酸：取马铃薯样品按质量体积比与提取缓冲液混合、研磨，将研磨所得混合体系置于37℃条件下完成孵育，加入氯仿旋涡震荡使其充分混合，离心所得上清液即为核酸溶液，取所得核酸溶液点样于正电荷尼龙膜的方格中，室温干燥后进行紫外交联固定核酸；步骤二、杂交：杂交液预热熔化后加入权利要求1所述检测PSTVd的探针，混匀后将步骤一完成核酸固定的正电荷尼龙膜置于杂交液中，杂交过夜；取出完成杂交的正电荷尼龙膜，依次用洗液I、洗液II和洗涤缓冲液进行洗涤；步骤三、阻断显色：配制1
×
阻断液和抗体液，将步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：白艳菊，王腾，张威，刘尚武，黄元炬，马爽，
申请(专利权)人：黑龙江省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。