一种同时检测4种烟草病毒的多重RT-PCR方法技术

本发明专利技术公开了一种同时检测4种烟草病毒的多重RT

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测4种烟草病毒的多重RT
‑
PCR方法


[0001]本专利技术属于烟草病毒检测
，具体涉及一种同时检测4种烟草病毒的多重RT
‑
PCR方法。

技术介绍

[0002]在我国，影响烟草作物的一些主要病毒包括烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)、辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,ChiVMV)、马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)和烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein
‑
banding mosaic virus,TVBMV)，严重影响烟草的产量和质量，造成了巨大的经济损失。
[0003]烟草花叶病毒是烟草花叶病毒属的模式成员，烟草花叶病毒感染许多植物物种，尤其是茄科植物，包括烟草、番茄、和胡椒。辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)、马铃薯Y病毒(PVY)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)属于马铃薯Y病毒属病毒的重要成员，主要由蚜虫以非持久性方式传播。
[0004]建立敏感、快速和经济的检测方法对于研究烟草作物中这些病毒的感染是必不可少的。分子生物学检测法从核酸水平检测病毒，因而灵敏度高、特异性强，能克服血清学及其他检测方法中的一些缺点，可以进行大批量的样本检测，是目前发展最快、最有发展前景的病毒检测技术。如RT
‑
PCR、核酸杂交、双链RNA(dsRNA)电泳、指示分子NASBA、环介导等温扩增及基因芯片技术等在病毒检测中的应用日趋广泛。目前国内多采用单重RT
‑
PCR，即在1个反应管中只能检测1种病毒。如要检测复合感染样品中的几种病毒，则需进行数次RT
‑
PCR反应，不仅操作步骤繁琐、易造成交叉污染，而且成本高、耗时长。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种同时检测4种烟草病毒的多重RT
‑
PCR方法，可同时检测四种烟草病毒TMV、ChiVMV、PVY和TVBMV。该多重RT
‑
PCR系统能够诊断与检测烟草病毒复合感染，可将其应用于烟草病毒感染的流行病学研究。
[0006]为了达到上述技术目的，本专利技术公开了一种同时检测4种烟草病毒的多重RT
‑
PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007]S1：总RNA的提取和逆转录：利用RNA提取试剂盒从健康和感染病毒的烟草叶片中提取总RNA，用反转录酶和随机引物通过两步反转录法，进行cDNA链的合成，反应完成后所获得的cDNA保存于
‑
20℃备用，反应体系如下：
[0008]第一步：
[0009][0010]第二步：
[0011][0012]S2：引物设计：根据病毒的病毒外壳蛋白基因的核苷酸序列设计引物；
[0013]S3：单PCR反应：
[0014]反应体系如下：
[0015][0016][0017]PCR程序：
[0018][0019]用2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，用GoldviewⅡ型核酸染色剂进行胶染，紫外光照射下拍照，通过与DL 1000DNAMarkers作为分子量标记的比较，确定扩增片段的分子大小；
[0020]S4：聚合酶链反应产物的克隆和测序：将RT
‑
PCR扩增产物中各病毒对应的特异性条带切胶，用普通琼脂糖凝胶DNA对试剂盒回收、纯化；回收的RT
‑
PCR产物与载体按反应体
系连接，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布于LB培养基平板上，培养，放置后进行蓝白斑筛选，用菌落PCR方法筛选含有插入物的克隆，筛选出的阳性单菌落接种于液体培养基中培养过夜；提取阳性克隆质粒进行测序；然后通过对NCBI核苷酸数据库的BLAST比对来验证这些序列；
[0021]S5：多重聚合酶链反应的优化：将制备好的4个病毒质粒以及内参基因质粒对多重PCR扩增进行优化，优化因素包括5对引物比例、退火温度、退火时间、延伸时间、循环周期；使用多重聚合酶链反应检测试剂盒扩增了25.0μL多重聚合酶链反应，反应体系为：
[0022][0023]引物(TMV(1.0μL)、TVBMV(0.5μL)、ChiVMV(2.0μL)、PVY(0.5μL)、EF
‑
1α(1.0μL)
[0024]PCR程序：
[0025][0026]用2.5％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，用GoldviewⅡ型核酸染色剂进行胶染，在紫外光照射下拍照，通过与DL 1000DNAMarkers作为分子量标记的比较，确定扩增片段的分子大小；
[0027]S6：多重RT
‑
PCR的稳定性检测：从混合病毒质粒溶液中省略了4种病毒的一种，加入引物对其进行扩增，来测试多重RT
‑
PCR的稳定性；
[0028]S7：多重聚合酶链反应的敏感性评价：以4种烟草病毒的等量质粒混合物为模板，经过10倍系列稀释，单个病毒序列通过简单聚合酶链反应和多重聚合酶链反应检测，初始质粒量设定为5pg；
[0029]S8：多重聚合酶链反应的应用：
[0030]采用优化后的多重RT
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PCR反应体系检测自然感染样品的烟草病毒；利用多重RT
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PCR单RT
‑
PCR检测从田间采集的烟草样品，琼脂糖凝胶电泳后，PCR产物的条带清晰，比较多重RT
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PCR单RT
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PCR检测的结果是否一致；若从不同的田间样品中获得的病毒扩增子的大小没有明显的差异，表明多重RT
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PCR方法可用于检测来自广泛田间区域的4种烟草病毒。
[0031]优选的，所述S1中的病毒为烟草花叶病毒(TMV)、辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草脉带花叶病毒(TVBMV)；RNA提取试剂盒为使用TaKaRaMiniBEST Universal RNAExtraction Kit提取试剂盒；反转录酶使用M
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MLV；
[0032]优选的，所述S2中设计各个病毒引物时需要选择具有相似退火温度、无非特异性扩增和各自扩增片段最佳大小的最佳引物对；每种目标病毒至少设计4对特异性引物；
[0033]优选的，所述S4中RT
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PCR产物的载体为pGD19
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T,RT
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PCR产物与载体的连接条件为16℃下连接2.5h；所述LB培养基平板涂布100mg/mL的Amp，过夜培养温度为37℃；阳性克隆质粒的测序用M13正向和反向引物(通用引物)进行测序；
[0034]优选的，所述S5中退火温度为44
‑
65℃，温度增量为3℃；退火时间为10
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60秒，时间增量为10秒；延伸时间为20
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测4种烟草病毒的多重RT
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PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：总RNA的提取和逆转录：利用RNA提取试剂盒从健康和感染病毒的烟草叶片中提取总RNA，用反转录酶和随机引物通过两步反转录法，进行cDNA链的合成，反应完成后所获得的cDNA保存于
‑
20℃备用，反应体系如下：第一步：第二步：S2：引物设计：根据病毒的病毒外壳蛋白基因的核苷酸序列设计引物；S3：单PCR反应：反应体系如下：体系如下：PCR程序：
用2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，用GoldviewⅡ型核酸染色剂进行胶染，在紫外光照射下拍照，通过与DL 1000DNAMarkers作为分子量标记的比较，确定扩增片段的分子大小；S4：聚合酶链反应产物的克隆和测序：将RT
‑
PCR扩增产物中各病毒对应的特异性条带切胶，用普通琼脂糖凝胶DNA对试剂盒回收、纯化；回收的RT
‑
PCR产物与载体按反应体系连接，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布于LB培养基平板上，培养，放置后进行蓝白斑筛选，用菌落PCR方法筛选含有插入物的克隆，筛选出的阳性单菌落接种于液体培养基中培养过夜；提取阳性克隆质粒进行测序；然后通过对NCBI核苷酸数据库的BLAST比对来验证这些序列；S5：多重聚合酶链反应的优化：将制备好的4个病毒质粒以及内参基因质粒对多重PCR扩增进行优化，优化因素包括5对引物比例、退火温度、退火时间、延伸时间、循环周期；使用多重聚合酶链反应检测试剂盒扩增了25.0μL多重聚合酶链反应，反应体系为：引物(TMV(1.0μL)、TVBMV(0.5μL)、ChiVMV(2.0μL)、PVY(0.5μL)、EF
‑
1α(1.0μL)PCR程序：
用2.5％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，用GoldviewⅡ型核酸染色剂进行胶染，在紫外光照射下拍照，通过与DL 1000DNAMarkers作为分子量标记的比较，确定扩增片段的分子大小；S6：多重RT
‑
PCR的稳定性检测：从混合病毒质粒溶液中省略了4种病毒的一种，加入引物对其进行扩增，来测试多重RT
‑
PCR的稳定性；S7：多重聚合酶链反应的敏感性评价：以4种烟草病毒的等量质粒混合物为模板，经过10倍系列稀释，单个病毒序列通过简单聚合酶链反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：冀新威，王建光，刘春明，侯秋强，陈思宇，李亚丽，李小琴，焦梦婷，张鲁民，杨晓琳，郭建，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：