阿龙山病毒环介导等温扩增检测引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种阿龙山病毒环介导等温扩增检测引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用。本发明专利技术根据阿龙山病毒基因组VP2基因的保守区设计了三套引物用于环介导等温扩增方法建立，最终筛选出一套用于检测的引物组。根据所设计的引物建立了一种基于环介导等温扩增技术检测阿龙山病毒的方法。本发明专利技术建立的LAMP检测方法特异性高，不与其他病毒交叉反应，且最低检测限可达到2.86copy/μL。应用于检测阿龙山病毒的检测，可以实现该病毒的即时检测，检测灵敏度和特异性高，人工和器材成本低，周期短。这种快检技术可推广应用于阿龙山病毒的流行病学调查和疫情监控，具有良好的实践意义和广阔的市场前景。和广阔的市场前景。

【技术实现步骤摘要】
阿龙山病毒环介导等温扩增检测引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及一种检测阿龙山病毒的环介导等温扩增引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用。本专利技术属于病毒检测


技术介绍

[0002]阿龙山病毒(Alongshan virus，ALSV)是一种新发现的分节段的黄病毒，主要通过蜱虫叮咬传播，感染牛、羊、人等。ALSV与荆门蜱病毒在进化上密切相关，基因组都分为四个片段，全长11350bp，S1片段长2995bp编码黄病毒NS5样NSP1蛋白；S3片段长2811bp编码黄病毒NS2b
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NS3样蛋白NSP2；S2片段长2806bp，编码糖蛋白VP1；S4片段长2738bp，编码核蛋白VP2和膜蛋白VP3。
[0003]阿龙山病毒是在我国的内蒙古的东北部地区首次发现，随后在芬兰和俄罗斯地区发现的蜱类体内发现。由于该病毒的是新发现的分节段黄病毒，目前阿龙山病毒的分子生物学、免疫学检测方法以及致病机制都是空白。而通过对黄病毒的综述分析，推断阿龙山病毒传播地区比目前所检测到地区更广，因此需要更快速、更简便的方法进行更多地区和更多宿主的检测。
[0004]环介导等温扩增(loop
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mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等人发展起来的。LAMP具有较高的特异性和灵敏度，使用简单，不需要专门的设备。LAMP是用具有链置换活性的BstDNA聚合酶(即来自嗜热脂肪芽孢杆菌的修饰DNA聚合酶)进行的。温度从60℃到65℃，在等温条件下在30
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60min内完成检测。最终的扩增产物是带有不同茎的茎环DNA的混合物，可以通过直接观察或通过琼脂糖凝胶进行分析。LAMP方法已被开发用于检测多种病毒，包括口蹄疫病毒、登革热病毒、风疹病毒和西尼罗河病毒，但尚未应用于检测ALSV。
[0005]本专利技术建立ALSV的LAMP检测方法，是特异、稳定，灵敏、高效的技术检测体系，在ALSV的检测方面具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的不足，本专利技术的首要目的在于提供一种检测ALSV的环介导等温扩增引物组。应用该引物组可为基层现场检测提供一种简便、快捷地检测ALSV的方法。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一种含有上述引物组的检测ALSV的环介导等温扩增反应试剂盒。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供上述引物组以及试剂盒在检测样品中ALSV中的应用。
[0009]为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0010]本专利技术从Genbank数据库中检索并获得所有ALSV的全基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到ALSV基因组相对保守的靶基因(VP2)序列，根据VP2序列，利用PrimerExplorerV5软件设计出用于ALSV检测的LAMP引物组，经筛选后最终得到了一套可特
异、灵敏的检测ALSV的引物组合物。
[0011]本专利技术的一种用于检测阿龙山病毒(Alongshan virus，ALSV)的环介导等温扩增引物组，所述的引物组由1对外引物F3/B3以及1对内引物FIP/BIP组成，所述的引物序列如下：
[0012]F3：TGATCTACATCCTCGCCGT
[0013]B3：CTGCTCCTGCTGTGAGTG
[0014]FIP：TGATTGCAGCTGCTGTCCCAGACCATGGGCAAGCCAAAC
[0015]BIP：TCATCAAGGAATTGCCCACGCATCTCCTCACCGGTTCTCAA。
[0016]其中，优选的，所述的外引物与内引物的摩尔比为1：8。
[0017]进一步的，本专利技术还提出了所述的引物组在制备检测阿龙山病毒的环介导等温扩增试剂中的应用。
[0018]更进一步的，本专利技术还提出了一种用于检测阿龙山病毒的环介导等温扩增试剂盒，所述的试剂盒包括以上所述的引物组。
[0019]其中，优选的，所述的试剂盒还包括荧光目视检测试剂、10
×
反应缓冲液、BstDNA聚合酶、超纯水，阳性标准品。
[0020]其中，优选的，使用所述的试剂盒检测的LAMP反应体系包括：10
×
反应缓冲液2.5μL，40pmol FIP和BIP各1μL，5pmol F3和B3各1μL，800U/mLBstDNA聚合酶1μL，30mM MgSO45μL，10mM dNTPmix 2.5μL，5.0M betaine 4μL，待检样品cDNA模板1μL，其余用超纯水补足至25μL。
[0021]其中，优选的，使用所述的试剂盒检测的LAMP反应条件为：将混合物在65℃下孵育60min，然后在80℃热失活10min后终止反应。
[0022]相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：
[0023]1、污染小，结果直观：本试剂盒的荧光目视试剂(FD)在反应前加入，污染小。其含有的钙黄绿素起初与锰离子结合而处于荧光淬灭状态。但是随着LAMP反应的进行，被反应副产物中的焦磷酸根离子夺去结合的锰离子，钙黄绿素恢复游离态从而发出荧光，并进而与反应液中的镁离子相结合，使荧光信号得到增强。
[0024]2、灵敏度高：本专利技术通过用10倍连续稀释阳性标准品的方法确定了LAMP反应的最低检测限。本专利技术的LAMP方法对ALSV的检测下限与其他虫媒病毒相似：最低检测限为2.86
×
100copy/μL。
[0025]3、特异性强：本专利技术的LAMP方法特异性好，用蜱传脑炎病毒(TBEV)；发热伴血小板减少综合征(SFTSV)；盖塔病毒(GETV)；巴泰病毒(BATV)的核酸进行ALSV
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LAMP检测，未发现阳性结果。
[0026]4、操作简便、快速：本专利技术建立的LAMP方法操作简便、无需复杂昂贵仪器。此外，建立的LAMP方法快速高效，从提取样品到结果判定可在60min内完成(时效性和TaqMan实时荧光定量PCR方法相当)。反应结果判定方法简单，LAMP反应的扩增产物用SYBR Green I染色，在紫外光照射下肉眼可检测到扩增产物。本专利技术可以实现ALSV的快速、即时检测，从而解决ALSV检测耗时、费力、高成本的缺陷，使检测灵敏度和特异性得到提高，降低人工和器材成本，缩短检测周期：本方法提供的快检技术可推广应用于ALSV的流行病学调查和疫情监控中，具有良好的实践意义和广阔的市场前景。
附图说明
[0027]图1为初步建立的检测ALSV的LAMP方法的琼脂糖电泳结果；
[0028]其中1为阳性；2为阴性对照；M：DNA分子量标准2000；
[0029]图2为LAMP方法检测ALSV的温度优化(琼脂糖电泳)；
[0030]其中1
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6分别为反应温度：65℃、64℃、63℃、62℃、61℃、60℃。7为阴性对照；M：DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测阿龙山病毒(Alongshanvirus，ALSV)的环介导等温扩增引物组，其特征在于：所述的引物组由1对外引物F3/B3以及1对内引物FIP/BIP组成，所述的引物序列如下：F3：TGATCTACATCCTCGCCGTB3：CTGCTCCTGCTGTGAGTGFIP：TGATTGCAGCTGCTGTCCCAGACCATGGGCAAGCCAAACBIP：TCATCAAGGAATTGCCCACGCATCTCCTCACCGGTTCTCAA。2.根据权利要求1所述的用于检测阿龙山病毒的环介导等温扩增引物组，其特征在于，所述的外引物与内引物的摩尔比为1：8。3.权利要求1或2所述的引物组在制备检测阿龙山病毒的环介导等温扩增试剂中的应用。4.一种用于检测阿龙山病毒的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组。5.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丽霞，员晓庆，刘昊，黄良宗，刘明杰，陈盛楠，
申请(专利权)人：广东方道基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：