本发明专利技术公开了一种肉制品或鹿茸中梅花鹿和马鹿源性同步检测的引物和探针及试剂盒，引物和探针序列如下：两源性检测正向引物序列如SEQ ID No.1所示；两源性检测反向引物序列如SEQ ID No.2所示；梅花鹿探针序列如SEQ ID No.3所示；马鹿探针序列如SEQ ID No.4所示；质控探针序列如SEQ ID No.5所示。本发明专利技术的引物、探针及试剂盒的特异性好、灵敏度高，可以实现肉制品或鹿茸中梅花鹿和马鹿源性以及质控同管检测，并且可以进行梅花鹿源性和马鹿源性的定量检测。定量检测。定量检测。
【技术实现步骤摘要】
梅花鹿和马鹿源性同步检测的引物和探针及试剂盒
[0001]本专利技术属于食品检测
，尤其涉及肉制品和鹿茸中梅花鹿和马鹿源性检测领域。
技术介绍
[0002]目前，动物制品真伪鉴别相关的技术研究、检测标准、专利技术专利以及商业试剂盒主要集中在单一通道单一源性检测和异管质控检测，同时多通道多源性检测和同管质控检测报道较少。
技术实现思路
[0003]本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的肉制品或鹿茸中梅花鹿源性和马鹿源性以及质控同管检测的引物、探针及试剂盒和方法，解决肉制品或鹿茸中梅花鹿和马鹿源性成分定性和定量检测问题。
[0004]本专利技术的技术方案为：肉制品或鹿茸中梅花鹿源性和马鹿源性以及质控同管检测的引物和探针，引物和探针序列如下：
[0005]两源性检测正向引物序列如SEQ ID No.1所示；
[0006]两源性检测反向引物序列如SEQ ID No.2所示；
[0007]梅花鹿探针序列如SEQ ID No.3所示；
[0008]马鹿探针序列如SEQ ID No.4所示；
[0009]质控探针序列如SEQ ID No.5所示。
[0010]进一步地，梅花鹿探针、马鹿探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，淬灭基团为TAMRA、 BHQ1或BHQ2中任意一种。
[0011]作为本专利技术的另一目的，提供了一种肉制品或鹿茸中梅花鹿源性和马鹿源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：
[0012]SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物，
[0013]SEQ ID No.2所示的两源性检测反向引物，
[0014]SEQ ID No.3所示的梅花鹿探针，
[0015]SEQ ID No.4所示的马鹿探针，
[0016]SEQ ID No.5所示的质控探针，
[0017]Probe qPCR预混液，
[0018]梅花鹿阳性标准品，
[0019]马鹿阳性标准品。
[0020]当然，也可以单独检测梅花鹿源性，为了节省成本，只需要去除马鹿源性相关的试剂即可(SEQ ID No.4所示的马鹿探针和马鹿阳性标准品)因此，作为本专利技术的另一目的，还提供了一种肉制品或鹿茸中梅花鹿源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：
[0021]SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物，
[0022]SEQ ID No.2所示的两源性检测反向引物，
[0023]SEQ ID No.3所示的梅花鹿探针，
[0024]SEQ ID No.5所示的质控探针，
[0025]Probe qPCR预混液，
[0026]梅花鹿阳性标准品。
[0027]当然，也可以单独检测马鹿源性，为了节省成本，只需要去除梅花鹿源性相关的试剂即可(SEQ ID No.3所示的梅花鹿探针和梅花鹿阳性标准品)因此，作为本专利技术的另一目的，还提供了一种肉制品或鹿茸中马鹿源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：
[0028]SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物，
[0029]SEQ ID No.3所示的两源性检测反向引物，
[0030]SEQ ID No.4所示的马鹿探针，
[0031]SEQ ID No.5所示的质控探针，
[0032]Probe qPCR预混液，
[0033]马鹿阳性标准品。
[0034]肉制品或鹿茸中梅花鹿源性和马鹿源性以及质控同管检测的方法，步骤如下：
[0035](1)提取肉制品或鹿茸的DNA；
[0036](2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100
‑
200ng/μL；
[0037](3)利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.5的引物和探针对稀释DNA进行多重荧光定量 PCR扩增，利用马鹿和梅花鹿阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；
[0038](4)Real
‑
time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取梅花鹿、马鹿和质控相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当质控Ct≤35和阳性对照 Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的 Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应多源性；
[0039](5)利用梅花鹿和马鹿阳性标准品做DNA定量的标准曲线；
[0040](6)利用检测肉制品和鹿茸的相应源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到肉制品和鹿茸中相应源性的定量检测结果。
[0041]进一步地，Real
‑
time PCR扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，31s，40个循环。
[0042]进一步地，Real
‑
time PCR反应体系为：Probe qPCR预混液10μL、SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物1μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.2所示的两源性检测反向引物 1μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.3所示的梅花鹿探针0.5μL，浓度为10μmol/L；、SEQID No.4所示的马鹿探针0.5μL，浓度为10μmol/L和SEQ ID No.5所示的质控探针0.5μL，浓度为10μmol/L；DNA模板2μL，灭菌的去离子水4.5μL，总体积20μL。
[0043]本专利技术通过比对梅花鹿、马鹿、牛、水牛、牦牛、驴、马、绵羊、山羊、猪、兔、骆驼、狗、鸡、鸭及鹅等16种动物的线粒体基因组，每种动物选取10个品种或品系的线粒体基因组序列。通过生物信息软件比对上述120条序列，筛选出梅花鹿和马鹿保守和特异的序列，利用
引物设计软件进行引物和探针的设计。设计的创新性在于需要在100
‑
150bp的序列上筛选出两端保守和中间特异的序列，两端保守的位置设计引物，中间特异的位置设计探针。保守的引物和特异的探针可以有效的减少引物之间的错配以及多个PCR反应对反应资源的竞争，可以保证多重实时荧光定量PCR反应的进行。多重实时荧光定量PCR反应是多源性成分检测的基础。引物和探针的退火温度控制在55
‑
60℃和65
‑
70℃，并且没有影响退火效率的二级结构，而且要保证引物和探针在线粒体基因上具有高度的特异性，上述设计保证引物和探针可以用于后续的定性和定量检测。
[0044]本专利技术研发了梅花鹿、马鹿及质控等3通道检测引物和探针，优化多通道多源性检测和同管质控检测的引物和探针组合。在此过程中克服了同一PCR反应体系中多种引物和探针之间的影响以及本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.肉制品或鹿茸中梅花鹿源性和马鹿源性以及质控同管检测的引物和探针，其特征在于，引物和探针序列如下：两源性检测正向引物序列如SEQ ID No.1所示，两源性检测反向引物序列如SEQ ID No.2所示，梅花鹿探针序列如SEQ ID No.3所示，马鹿探针序列如SEQ ID No.4所示，质控探针序列如SEQ ID No.5所示。2.根据权利要求1所述的肉制品或鹿茸中梅花鹿源性和马鹿源性以及质控同管检测的引物和探针，其特征在于，梅花鹿探针、马鹿探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，淬灭基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2中任意一种。3.肉制品或鹿茸中梅花鹿源性和马鹿源性以及质控同管检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物，SEQ ID No.2所示的两源性检测反向引物，SEQ ID No.3所示的梅花鹿探针，SEQ ID No.4所示的马鹿探针，SEQ ID No.5所示的质控探针，Probe qPCR预混液，梅花鹿阳性标准品，马鹿阳性标准品。4.肉制品或鹿茸中梅花鹿源性以及质控同管检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物，SEQ ID No.2所示的两源性检测反向引物，SEQ ID No.3所示的梅花鹿探针，SEQ ID No.5所示的质控探针，Probe qPCR预混液，梅花鹿阳性标准品。5.肉制品或鹿茸中马鹿源性以及质控同管检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：SEQ ID No.1所示的两源性检测正向引物，SEQ ID No.2所示的两源性检测反向引物，SEQ ID No.4所示的马鹿探针，SEQ ID No.5所示的质控探针，Probe qPCR预混液，马鹿阳性标准品。6.肉制品或鹿茸中梅花鹿源性、马鹿源性以及质控同管检测的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)提取肉制品或鹿茸的DNA；(2)检测DNA的浓度...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭梁，罗建兴，刘国强，徐伟良，廖成松，李春冬，牧其尔，
申请(专利权)人：锡林郭勒职业学院，
类型：发明
国别省市：
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