一种人肺癌免疫多标及空间转录组检测组合方法技术

本发明专利技术公开了一种人肺癌免疫多标及空间转录组检测组合方法，具体包括以下几个步骤：S1、在组织样本上同时标记PD

【技术实现步骤摘要】
一种人肺癌免疫多标及空间转录组检测组合方法


[0001]本专利技术涉及一种医疗
，具体涉及一种人肺癌免疫多标及空间转录组检测组合方法。

技术介绍

[0002]恶性肿瘤一直以来都是人类健康的一大主要威胁。WHO在2020年的调查中指出，癌症已是人类的第二大致死原因，每年都约有1000万人死于癌症，这占每年死亡人数的15％以上。因而，围绕着肿瘤的治疗与药物开发都是目前的研究热点。
[0003]近年来对于癌症的精准治疗方案不断的发展进步，主要是源于肿瘤异质性及个体差异研究的深入。肿瘤内部是一个非常复杂的环境，除了肿瘤细胞以外，各免疫细胞类群相互作用，肿瘤细胞和免疫细胞等共同组成了一个非常复杂而又异质化的组织场景，其对于肿瘤的发生、发展和转移有至关重要的影响，也给肿瘤的定性和治疗带来了一定的困难。
[0004]在癌症病人组织异质性和免疫微环境检测当中，过去常使用的方法为获得病人的组织样本后进行流式细胞分型，从而了解肿瘤细胞的数量及其中各类免疫细胞的比例。但此方法无法获得组织原位的细胞标记信息。另一种免疫细胞分型的方法为在组织层面进行免疫组化标记。但免疫组化标记每次只能对一种细胞标记物进行标记。因而在一个组织样本上只能获得一种生物标记物的信息，对于细胞类群的确定或细胞分型没有任何应对能力。
[0005]另一方面，随着二代测序等分子水平的检测方式的发展，其可以对均值化的组织悬液进行分析。但是对于肺组织来说，其具有肺泡、气管等不同的组织结构，其次，在肿瘤环境中也有肿瘤内部和肿瘤外部的基因表达和蛋白表达的异质性。在基因表达水平上，若使用均值化的测试方式(bulk analysis)，则所有的亚克隆数据都会被平均化，最终只会显示哪些表达水平最高的克隆。而这样的检测方法必然是不准确的。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种人肺癌免疫多标及空间转录组检测组合方法；通过一次性在同一组织样本上的两张连续切片上完成，一张进行组织多标的标记，标记6种抗原，从而可以获得组织中6种蛋白的表达水平，获得6种以上不同细胞类群的分类及原位信息，特别是在检测各细胞类群的同时对PD
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1/PD
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L1免疫检测点同步进行检测，对肿瘤的免疫治疗提供依据；
[0007]另外一张连续切片进行10X空间转录组的分析、定量，可以从不同的位点(spot)中收集到多维度和具有空间信息的基因表达分析，对于每一个位点(spot)的测序结果，其都可以通过空间定位对应到组织样本上，可以获得细胞亚群的分布和表达的信息，便于判断肿瘤的增殖转移。
[0008]本专利技术人肺癌免疫多标及空间转录组检测组合方法是通过以下技术方案来实现的：具体包括以下几个步骤：
[0009]S1、在组织样本上同时标记PD
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1/PD
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L1/CD8/CD68/Foxp3/PanCK六种抗原，并同时使用DAPI对细胞核进行染色，并对颜色进行采集；
[0010]S2、对六种抗原进行分别标记；
[0011]S3、计算肿瘤区和非肿瘤区中各细胞类群的数量；
[0012]S4、通过10X genomics技术，对同一样本上的基因水平进行检测。
[0013]作为优选的技术方案，S1、在组织样本上同时标记PD
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1/PD
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L1/CD8/CD68/Foxp3/PanCK六种抗原，并同时使用DAPI对细胞核进行染色，具体操作方式如下：
[0014]SS1、对PD
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1/PD
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L1/CD8/CD68/Foxp3/PanCK六种抗原分别与一种染料相搭配对应；
[0015]SS2、在荧光显微镜对每种荧光信号进行采集，不同的抗原表达强弱可指征不同的细胞类群。
[0016]作为优选的技术方案，S2、对六种抗原进行分别标记，具体操作方式如下：
[0017]SS1、PanCK作为肿瘤标志物，其标记区域则为肿瘤区域；CD8阳性为杀伤性T细胞的标记；Foxp3阳性细胞为调节性T细胞；CD68+细胞为巨噬细胞；PD
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1和PD
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L1作为重要的免疫检测点分别进行标记。
[0018]作为优选的技术方案，S4、通过10X genomics技术，对同一样本上的基因水平进行检测，具体操作方式如下：
[0019]SS1、通过HE染色，获得组织原位的空间信息；
[0020]SS2、将组织细胞中的mRNA进行透化释放与切片表面的barcode互补结合(spatially barcoded oligo
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deoxythymidine microarrays)，后续通过建库、测序，获得细胞中完整的转录组数据。
[0021]本专利技术的有益效果是：
[0022]通过一次性在同一组织样本上的两张连续切片上完成，一张进行组织多标的标记，标记6种抗原，从而可以获得组织中6种蛋白的表达水平，获得6种以上不同细胞类群的分类及原位信息，特别是在检测各细胞类群的同时对PD
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1/PD
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L1免疫检测点同步进行检测，对肿瘤的免疫治疗提供依据；
[0023]另外一张连续切片进行10X空间转录组的分析、定量，可以从不同的原位位点中收集到多维度和具有空间信息的基因表达分析，对于每一个位点的测序结果，其都可以通过空间定位对应到组织样本上，可以获得细胞亚群的分布和表达的信息，便于判断肿瘤的增殖转移。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]图1为Panel组成及细胞类群分类实例的示意图；
[0026]图2为空间转录组的操作流程的示意图；
[0027]图3为人肺癌肿瘤免疫多标Panel实例的示意图；
[0028]图4为人肺癌肿瘤免疫多标Panel单通道展示的示意图；
[0029]图5为各细胞类群在不同组织类型区的细胞数量分布的示意图；
[0030]图6为人肺癌免疫多标及空间转录组检测组合的示意图；
[0031]图7为空间转录组细胞类群分布示意图；
[0032]图8为细胞类群分布t
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SNE展示图；
[0033]图9为Cluster 3细胞类群高表达基因清单；
[0034]图10为人肺癌免疫多标及空间转录组组合检测流程的示意图；
[0035]图11为免疫多色标记染色的实验流程的示意图；
[0036]图12为空间转录组基因表达方案实验流程的示意图。
具体实施方式
[0037]本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人肺癌免疫多标及空间转录组检测组合方法，具体包括以下几个步骤：S1、在组织样本上同时标记PD
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1/PD
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L1/CD8/CD68/Foxp3/PanCK六种抗原，并同时使用DAPI对细胞核进行染色，并对颜色进行采集；S2、对六种抗原进行分别标记；S3、计算肿瘤区和非肿瘤区中各细胞类群的数量；S4、通过10X genomics技术，对同一样本上的基因水平进行检测。2.根据权利要求1所述的人肺癌免疫多标及空间转录组检测组合方法，其特征在于：所述S1、在组织样本上同时标记PD
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1/PD
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L1/CD8/CD68/Foxp3/PanCK六种抗原，并同时使用DAPI对细胞核进行染色，具体操作方式如下：SS1、对PD
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1/PD
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L1/CD8/CD68/Foxp3/PanCK六种抗原分别与一种染料相搭配对应；SS2、在荧光显微镜对每种荧光信号进行采集...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞圣如，侯纯纯，韦贝贝，曹晓黎，黄毅，
申请(专利权)人：云准医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：