一种犬瘟热病毒抗体检测试剂盒和编码犬瘟热病毒核蛋白的基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种犬瘟热病毒抗体检测试剂盒和编码犬瘟热病毒核蛋白的基因及其应用，属于生物技术领域。为了提供一种有效、快速检测犬瘟热病毒抗体的方法。本发明专利技术提供了一种犬瘟热病毒的抗体检测试剂盒：包括犬瘟热病毒核蛋白、犬瘟热病毒阳性血清、犬瘟热病毒阴性血清、犬瘟热病毒抗体和二抗。检测的时间为1分钟，检测的灵敏度为效价在1:8～1:16，可用于特异性的鉴定动物体内是否有犬瘟热病毒，以确定是否引发感染。是否引发感染。是否引发感染。

【技术实现步骤摘要】
一种犬瘟热病毒抗体检测试剂盒和编码犬瘟热病毒核蛋白的基因及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种犬瘟热病毒抗体检测试剂盒和编码犬瘟热病毒核蛋白的基因及其应用。

技术介绍

[0002]犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)感染引起的急性、烈性、高度接触性传染病。双相热、结膜炎、呼吸系统和消化系统疾病为该病的主要病症，发展到后期出现典型的神经症状。其高发病率和死亡率对犬养殖业和野生动物保护造成了巨大的损失，也是伴侣动物巨大的威胁。CDV属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)。CDV和麻疹病毒(Measles virus,MV)、小反刍兽医病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)、牛瘟病毒(Rinderpest virus,RPV)同属。CDV病毒颗粒呈多形性(通常为圆形)直径约为150nm，是一种有囊膜的单股负链不分节段的RNA病毒。现在亟需一种检测动物体内是否存在犬瘟热病毒抗体的方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是为了提供一种有效、快速检测犬瘟热病毒抗体的方法。
[0004]本专利技术提供了一种犬瘟热病毒的抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括犬瘟热病毒核蛋白、犬瘟热病毒阳性血清、犬瘟热病毒阴性血清、犬瘟热病毒抗体和二抗。
[0005]进一步地限定，所述抗体检测试剂盒还包括PVC底板、金标垫、样品垫和吸水垫。
[0006]进一步地限定，所述犬瘟热病毒核蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]进一步地限定，所述犬瘟热病毒核蛋白与标记胶体金混合得到混合物，所述混合物的终浓度为10μg/mL。
[0008]进一步地限定，所述胶体金的制备方法如下：
[0009](1)1％的氯化金水溶液1mL，加入99mL超纯水，配置成0.01％的HAuCl4溶液，加热至沸腾；
[0010](2)加入1.5mL 1％柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热沸腾2～5min，金黄色的氯金酸水溶液在2min内颜色发生迅速变化，由灰色变成黑色最后变成紫红色，继续煮沸20min得到稳定的胶体金溶液。
[0011]进一步地限定，所述犬瘟热病毒核蛋白与标记胶体金混合的方法如下：
[0012](1)用0.2mol/L K2CO3溶液调节胶体金溶液至pH8.0，加入犬瘟热病毒核蛋白，加入10％BSA，混合物的终浓度为10μg/mL；
[0013](2)然后将犬瘟热病毒核蛋白溶液10000rpm 4℃离心15min，弃上清，用复溶液溶解浓缩沉淀，复溶液浓缩比例为125μL/mL；
[0014](3)将浓缩后的胶体金复合物喷涂于胶体金垫内，喷涂量为15μL/cm。
[0015]进一步地限定，步骤(2)所述复溶液的成分如下：10％蔗糖、1％PVP、1％BSA、0.5％
Tween
‑
20和0.1MTrisCl，pH 8.5。
[0016]进一步地限定，犬瘟热病毒抗体的工作浓度为1.0mg/mL。
[0017]本专利技术提供一种编码犬瘟热病毒核蛋白的基因，所述基因的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0018]本专利技术提供上述的基因在检测犬瘟热病毒抗体和制备犬瘟热病毒核蛋白中的应用。
[0019]有益效果：本专利技术提供一种检测检测犬瘟热病毒抗体的方法，检测的时间为xx，检测的灵敏度为效价在1:8～1:16，可用于鉴定动物体内是否有犬瘟热病毒，以确定是否引发感染。
附图说明
[0020]图1为蛋白小量表达胶图，其中，M：Marker，1：未诱导对照(BL21)2
‑
3：IPTG诱导；
[0021]图2为蛋白小量表达胶图，其中，M：Marker 1：未诱导对照(Rosetta)2
‑
3：IPTG诱导(Rosetta)，4：未诱导对照(Condon)5
‑
6：IPTG诱导(Condon)，7：未诱导对照(BL21plys)8
‑
9：IPTG诱导(BL21 plys)，12％SDS
‑
PAGE；
[0022]图3为蛋白大量表达胶图12％SDS
‑
PAGE，其中，M：Marker，1：超声后全菌，2：超声后上清，3：超声后沉淀；
[0023]图4为蛋白大量表达纯化胶图，其中，M：Marker，1：纯化蛋白稀释5倍，2：纯化蛋白稀释10倍；
[0024]图5为蛋白大量表达纯化胶图，其中，M：Marker 1：复性后蛋白12％SDS
‑
PAGE；
[0025]图6为蛋白质谱检测比对结果；
[0026]图7为试纸条组装模式图，其中，sample pad为样品垫，conjugated pad为结合垫，N.C.membrace为酸纤维素膜，absorption pad为吸水垫，plastic backing为塑料外壳；
[0027]图8为犬阳性血清与重组犬瘟热核蛋白免疫印迹，其中，泳道1&2：CDV毒株，泳道3：重组犬瘟热核蛋白，泳道4：Vero细胞；
[0028]图9为犬瘟热病毒血清纯化检测，其中，1是Marker，2是犬血清；
[0029]图10试纸条组装模式图；
[0030]图11为为试纸条特异性实验结果，其中，1：H2O，2：PBS，3：阴性血清，4：细小病毒阳性血清，5：水貂阿留病毒阳性血清，6：犬瘟热病毒阳性血清；
[0031]图12为犬瘟热病毒抗体检测试纸条敏感性实验结果，其中，1：CDV阳性血清(1:256)，2：CDV阳性血清(1:128)，3：CDV阳性血清(1:64)，4：CDV阳性血清(1:32)，5：CDV阳性血清(1:16)，6：CDV阳性血清(1:8)，7：CDV阳性血清(1:4)，8：CDV阳性血清(1：2)，9：PBS；
具体实施例
[0032]LB培养基:胰蛋白胨(tryptone)10g；酵母提取物(yeast extract)5g；氯化钠(NaCl)10g；固体培养基另加琼脂粉15
‑
20g；加双蒸水至1000mL,用5mol/L NaOH(约0.2ml)调pH至7.2，121℃灭菌30min。卡那霉素浓度：100mM，细菌重悬液：10mM Tris
‑
HCl(pH 8.0)溶液。细菌感受态：感受态细胞(BL21，Condon，Rosetta，BL21 plys)。
[0033]PVC底板、金标垫、样品垫、吸水垫购自上海杰一生物公司。
[0034]划线喷膜仪和微电脑自动斩切机，购自上海金标公司。
[0035]免疫印迹实验材料：脱脂乳(5％浓度)；PBS(0.1M PH7.6)；一抗(犬血清，1:200稀释；50μL:10ml)；二抗(HRP标记抗犬抗体；1:1000稀释；10μL:10本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种犬瘟热病毒的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括犬瘟热病毒核蛋白、犬瘟热病毒阳性血清、犬瘟热病毒阴性血清、犬瘟热病毒抗体和二抗。2.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述抗体检测试剂盒还包括PVC底板、金标垫、样品垫和吸水垫。3.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述犬瘟热病毒核蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。4.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述犬瘟热病毒核蛋白与标记胶体金混合得到混合物，所述混合物的终浓度为10μg/mL。5.根据权利要求4所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金的制备方法如下：(1)1％的氯化金水溶液1mL，加入99mL超纯水，配置成0.01％的HAuCl4溶液，加热至沸腾；(2)加入1.5mL 1％柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热沸腾2～5min，金黄色的氯金酸水溶液在2min内颜色发生迅速变化，由灰色变成黑色最后变成紫红色，继续煮沸20min得到稳定的胶体金溶液。6.根据权利要求4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：易立，程悦宁，王振军，罗国良，冯二凯，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：