本发明专利技术提供一种噬菌体裂解酶结合BLI快速检测S.aureus的方法，涉及金黄色葡萄球菌检测技术领域，解决了S.aureus传统检测方法步骤多、操作繁琐、耗时长的问题。包括以下步骤：一是传感器活化，二是裂解酶的固定化，三是将AR2G传感器封闭，四是样品检测及结果判断。本发明专利技术操作简单、实时监测、无标记、结果易得；实现样品随到随检，可以在较短的时间完成样品中目标菌的识别检测，根据样品中所含金黄色葡萄球菌浓度的不同，单纯的样品检测时间可以控制在数十秒到十几分钟之内；裂解酶对目标菌可以特异的识别，保证该方法的特异性，排除非目标菌的潜在干扰；通过信号曲线有无峰的出现可以进行死活菌的区分；裂解酶易于获得，方便制备。方便制备。方便制备。
【技术实现步骤摘要】
一种噬菌体裂解酶结合BLI快速检测S.aureus的方法
[0001]本专利技术属于金黄色葡萄球菌检测
，更具体地说，特别涉及一种噬菌体裂解酶结合BLI快速检测S.aureus的方法。
技术介绍
[0002]金黄色葡萄球菌(S.aureus)是自然界普遍存在的一种革兰氏阳性菌，是一种常见的食源性病原体，对食品加工业和人类健康有潜在危害。此外，它营养需求低，对不利环境有很强的抵抗力，可引起人类和动物传染病。因此，采用快速准确的检测方法检测S.aureus，可以大大减少食物中毒事件的发生。
[0003]传统的S.aureus检测方法存在周期长、操作复杂等缺点，难以满足实际需要。随着分子生物学技术的不断发展，多种基于核酸检测的方法被应用于食源性病原体的检测，其中经典的聚合酶链反应(PCR)在快速、高灵敏度和强特异性方面显示出显著优势。然而，除了需要严格的温度控制措施、熟练的技术人员和昂贵的实验室设备外，经典PCR还经常受到外源污染物的干扰从而引起假阳性结果；此外，经典PCR不能区分死活菌。
[0004]因此，快速便捷、灵敏准确、易于操作且能够区分死活菌的S.aureus新型检测方法亟需开发。
技术实现思路
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种噬菌体裂解酶LysGH15结合BLI快速检测S.aureus的方法，以解决S.aureus传统检测方法步骤多、操作繁琐、耗时长的问题。
[0006]本专利技术一种噬菌体裂解酶LysGH15结合BLI快速检测S.aureus的方法的目的与功效，由以下具体技术手段所达成：
[0007]一种噬菌体裂解酶LysGH15结合BLI快速检测S.aureus的方法，包括以下步骤：
[0008]1)、传感器活化：
[0009]将AR2G传感器的末端浸入蒸馏水中预湿至少十分钟后，浸入40mM的1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和20mM的N
‑
羟基琥珀酰亚胺混合活化试剂中活化150
‑
450秒；
[0010]2)、裂解酶的固定化：
[0011]将活化后的AR2G传感器浸入用pH4
‑
6的醋酸
‑
醋酸钠缓冲溶液稀释的浓度为12.5
‑
100μg/mL的突变的LysGH15中进行固定化600
‑
900秒；
[0012]3)、封闭：
[0013]裂解酶固定化后，将AR2G传感器依次浸入1M乙醇胺盐酸盐溶液和1％牛血清白蛋白溶液中封闭150
‑
450秒；
[0014]4)、样品检测及结果判断：
[0015]将已封闭的AR2G传感器浸入含有0.02％吐温
‑
20的磷酸盐缓冲溶液中平衡150
‑
450秒，然后将其浸入样品中进行S.aureus的检测，实时读取结合信号；
[0016]对于定性分析，当结合信号值大于等于仪器的有效信号值0.0075nm即可判定样品中存在S.aureus；
[0017]对于定量分析，将结合时间为3分钟、6分钟、9分钟和12分钟的结合信号值y分别代入菌浓度和结合信号间的数学公式(1)、(2)、(3)、(4)，求解所得的浓度即为样品中S.aureus的具体浓度，通过多组数据进行对比，保证检测结果的准确性，提高检测结果的严谨性和实时性，保证最终数据的可信度。
[0018]优选地，步骤1)中具体活化时间设置为200
‑
300秒时，高效地对传感器表面修饰的羧基基团进行活化，保证后续噬菌体裂解酶的有效固定化。
[0019]优选地，步骤2)中具体操作时，将活化后的AR2G传感器浸入用pH5
‑
6的醋酸
‑
醋酸钠缓冲溶液稀释的浓度为50
‑
100μg/mL的突变的LysGH15中进行固定化600
‑
900秒，使传感器与裂解酶溶液充分接触，从而使溶液中的裂解酶足量且牢固地固定在AR2G传感器上。
[0020]优选地，步骤3)中具体封闭时间可以设置为300秒，使AR2G传感器上未固定噬菌体裂解酶的多余的结合位点被封闭掉，从而避免非特异性结合信号的产生，确保检测结果的准确性。
[0021]优选地，步骤4)中数学公式(1)、(2)、(3)、(4)分别为：
[0022](1)：y＝0.79905+0.79353/(1+exp((C3‑
5.95133)/0.35))；
[0023](2)：y＝0.9241
‑
0.91576/(1+exp((C6‑
5.92917)/0.52574))；
[0024](3)：y＝1.012
‑
1.00252/(1+exp((C9‑
5.94227)/0.59033))；
[0025](4)：y＝1.07043+1.06011/(1+exp((C
12
‑
5.98079)/0.61363))。
[0026]优选地，数学公式(1)、(2)、(3)、(4)中：
[0027]C3表示结合时间为3分钟时求得的菌浓度，对应的S.aureus的最低检出限是151CFU/mL；
[0028]C6表示结合时间为6分钟时求得的菌浓度，对应的S.aureus的最低检出限是38CFU/mL；
[0029]C9表示结合时间为9分钟时求得的菌浓度，对应的S.aureus的最低检出限是18CFU/mL；
[0030]C
12
表示结合时间为12分钟时求得的菌浓度，对应的S.aureus的最低检出限是13CFU/mL。
[0031]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0032]本专利技术噬菌体裂解酶结合BLI快速检测S.aureus的方法优点在于：
[0033](1)操作简单、实时监测、无标记、结果易得容易分析；
[0034](2)检测所需的时间短，因为其他步骤在上机检测之前均可以准备妥当，可以实现样品随到随检，由于裂解酶的识别功能很强，可以在较短的时间完成样品中目标菌的识别检测，根据样品中所含金黄色葡萄球菌浓度的不同，单纯的样品检测时间可以控制在数十秒到十几分钟之内；
[0035](3)裂解酶对目标菌可以特异识别，从而保证该方法的特异性，排除非目标菌的潜在干扰；
[0036](4)有活性的LysGH15进行二次结合之后，活菌的信号值曲线出现先上升
‑
下降
‑
上升的现象即有峰出现，但是死菌的信号值一直呈现递增的状态，通过信号曲线有无峰的出
现可以进行死活菌的区分；
[0037](5)裂解酶易于获得，方便制备；
[0038](6)检测高通量，配合相应的生物分子相互作用仪及配套使用的样本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种噬菌体裂解酶结合BLI快速检测S.aureus的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)、传感器活化：将AR2G传感器的末端浸入蒸馏水中预湿至少十分钟后，浸入40mM的1
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乙基
‑
(3
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和20mM的N
‑
羟基琥珀酰亚胺混合活化试剂中活化150
‑
450秒；2)、裂解酶的固定化：将活化后的AR2G传感器浸入用pH4
‑
6的醋酸
‑
醋酸钠缓冲溶液稀释的浓度为12.5
‑
100μg/mL的突变的LysGH15中进行固定化600
‑
900秒；3)、封闭：裂解酶固定化后，将AR2G传感器依次浸入1M乙醇胺盐酸盐溶液和1％牛血清白蛋白溶液中封闭150
‑
450秒；4)、样品检测及结果判断：将已封闭的AR2G传感器浸入含有0.02％吐温
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20的磷酸盐缓冲溶液中平衡150
‑
450秒，然后将其浸入样品中进行S.aureus的检测，实时读取结合信号；对于定性分析，当结合信号值大于等于仪器的有效信号值0.0075nm即可判定样品中存在S.aureus；对于定量分析，将结合时间为3分钟、6分钟、9分钟和12分钟的结合信号值y分别代入菌浓度和结合信号间的数学公式(1)、(2)、(3)、(4)，求解所得的浓度即为样品中S.aureus的具体浓度，通过多组数据进行对比，保证最终数据的可信度。2.如权利要求1所述一种噬菌体裂解酶结合BLI快速检测S.aureus的方法，其特征在于：步骤1)中具体活化时间设置为200
‑
300秒。3.如权利要求1所述一种噬菌体裂解酶结合BLI快速检测S.aureus的方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：顾敬敏，刘潇，张晓光，韩文瑜，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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