靶向调控线粒体呼吸链的微纳水凝胶微球及其制备与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种靶向调控线粒体呼吸链的微纳水凝胶微球及其制备与应用。本发明专利技术通过微流控技术制备透明质酸微球，并将SS

【技术实现步骤摘要】
靶向调控线粒体呼吸链的微纳水凝胶微球及其制备与应用


[0001]本专利技术属于生物医学工程材料
，涉及一种水凝胶微球，具体涉及一 种靶向调控线粒体呼吸链的微纳水凝胶微球及其制备与应用。

技术介绍

[0002]线粒体是真核细胞中的重要细胞器，通过细胞凋亡、自噬等多个途径调节能 量代谢和细胞周期，是真核细胞的“能源工厂”。线粒体呼吸链(MRC)是电 子传递(ETC)与三磷酸腺苷(ATP)合成相互偶联的过程，该过程在线粒体内 膜(IMM)上进行。当细胞在衰老、炎症等多因素的影响下，线粒体呼吸链的 电子传递发生电子漏，泄漏的电子直接与氧分子形成氧自由基，导致氧化应激增 加；另一方面，受损的线粒体呼吸链还会出现质子漏，使线粒体呼吸链断裂、 ATP生成减少，进一步促进中枢神经系统、心脏、肾脏和骨骼肌肉系统发生退行 性变化。由于MRC在调控细胞的能量代谢和氧化应激中起关键作用，因此，改 善MRC的电子传递效率，恢复呼吸链复合体活性，对于有效治疗多种与MRC 功能失常相关的退行性疾病是非常有前景的。然而，由于线粒体所处于亚细胞室 和细胞内环境的复杂性，如何精准地将治疗药物运输到线粒体中仍需要克服多种 生理屏障。
[0003]目前，基于以亚细胞结构为靶向的生物材料平台有可能成为治疗与线粒体功 能障碍相关疾病的强大工具。以三苯基膦(TPP)作为线粒体靶向装置，修饰于 药物分子或纳米粒子表面，是报道最多的策略。然而，该方法存在靶向效率较低、 破坏线粒体电子传递链、细胞毒性作用等不足之处。另有报道基于精氨酸修饰的 脂肽(DLP)或者R8(八聚精氨酸)修饰的MITO
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Porter脂质体，这些线粒体 靶向纳米颗粒模仿了天然线粒体前体蛋白(MPP)中的特定氨基酸结构域，提高 了线粒体的靶向递送能力。但是，这些与MPP相似的多肽与线粒体结合时，影 响了线粒体正常膜电位，具有一定的毒性作用。因此，上述这些纳米材料大部分 具有破坏线粒体结构和细胞毒性作用而主要应用于肿瘤的治疗，即该类生物材料 的应用目的在于“破坏”而非“修复”。
[0004]然而，在以骨关节炎(OA)为代表的与MRC功能紊乱相关的退行性疾病 中，上述这些靶向破坏线粒体的生物材料并不适合OA这类需要修复MRC的退 行性疾病。OA是一种慢性进行性软骨退行性疾病，发病率和致残率高，在炎症 因子、异常机械应力等的影响下，软骨细胞的MRC功能会受损，线粒体膜通透 性增加，细胞色素C和凋亡诱导因子等从线粒体释放到细胞质，诱导软骨细胞 凋亡和细胞外基质降解等。因此，MRC功能紊乱是OA发生、进展的重要机制， 当前迫切需要一种更安全、稳定的靶向线粒体的生物材料，治疗这些与MRC功 能紊乱相关的退行性疾病。
[0005]为了改善靶向线粒体的纳米颗粒的安全性，一种新型线粒体靶向肽(MTS) ——Elamipretide(SS
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31)近年来得到了较多的关注。SS
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31是一种能被细胞摄 取的四肽，可特异性的与线粒体内膜结合，并改善内膜嵴弯曲，使细胞的线粒体 电子传递链恢复活力，减少ROS产生。因此，使用SS
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31取代R8修饰脂质体， 可以解决细胞毒性问题，同时保留了对线粒体内膜的靶向性。此外，白藜芦醇是 一种SIRT蛋白激动剂，Sirtuin 3(SIRT3)作为一种
线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸(NAD)依赖的蛋白去乙酰化酶，是线粒体氧化还原稳态的主要调节因子， 可以调节MRC以维持正常的氧化机制，所以靶向线粒体递送白藜芦醇，能更有 效地增强它保护MRC的功能。然而，在OA患者的关节腔内，由于软骨的炎症 细胞会分泌多种炎症因子和金属蛋白酶(MMPs)，使滑膜组织处于炎症肿胀状 态，当多肽和药物在关节腔内直接暴露时容易被炎症滑膜的血管清除代谢，通常 需要多次使用才能达到治疗效果。
[0006]因此，如何解决靶向调控线粒体呼吸链的脂质体在关节腔的复杂递送问题， 以期为治疗多种与MRC功能紊乱相关的退行性疾病提供依据，提升治疗指数， 成为现阶段亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的就是为了解决上述技术问题，从而提供一种靶向调控线粒体 呼吸链的微纳水凝胶微球及其制备与应用。本专利技术提供的微纳水凝胶微球系统具 有高效的细胞摄取效率和线粒体靶向性，该系统能显著提高MRC功能，减少质 子泄漏，保护线粒体，下调ROS的表达，促进软骨细胞外基质的生成。同时体 内实验证明该系统在大鼠骨关节炎模型中可以有效的减缓骨性关节炎的进展。
[0008]本专利技术的目的之一是提供一种靶向调控线粒体呼吸链的微纳水凝胶微球的 制备方法，其包括以下步骤：
[0009](1)将SS
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31肽与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
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聚乙二醇2000
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琥珀酰亚胺酯 发生酯化反应，得到功能化合物一；
[0010](2)将Wyrgrl肽的羧基经EDC/NHS活化后与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
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N
‑ꢀ
氨基
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聚乙二醇5000发生反应，得到功能化合物二；
[0011](3)将功能化合物一和功能化合物二与蛋黄卵磷脂、胆固醇和白藜芦醇混 合，有机溶剂溶解，通过薄膜水化法制备得到纳米脂质体；
[0012](4)采用透明质酸与甲基丙烯酸酐合成甲基丙烯酸化透明质酸水凝胶，然 后将步骤(3)所得纳米脂质体与水凝胶溶液混合，通过微流控装置制备水凝胶 微球，然后经紫外光交联，得到所述微纳水凝胶微球。
[0013]本专利技术制备了以SS
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31与特异性II型胶原靶向肽(Wyrgrl)修饰的负载白藜 芦醇的长循环脂质体，并将该脂质体通过非共价键连接在水凝胶微球的纳米网络 内，Wyrgrl与SS
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31的修饰使脂质体具有靶向关节软骨细胞线粒体的能力，且 SS
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31能稳定线粒体内膜心磷脂(CL)结构，与SIRT3激活剂白藜芦醇(REV) 发挥协同作用，改善细胞MRC电子传递效率，从而构建了一种具有靶向调控线 粒体呼吸链功能的微纳水凝胶微球体系。该体系在与软骨细胞共培养时，活死染 色验证了该体系具有良好的生物相容性，流式细胞技术与免疫荧光标记实验则证 明了SS
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31修饰的脂质体具有优良的细胞摄取率和线粒体靶向性；细胞能量代谢 和分子生物学实验进一步验证了该体系能有效减少氧化应激状态下的软骨细胞 线粒体呼吸链质子漏，恢复ATP生成，且脂质体内释放的白藜芦醇(REV)可 通过激活SIRT3蛋白，与SS
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31发挥协同作用以恢复线粒体呼吸链的正常功能。 此外，在动物实验中观察到该体系最能有效恢复软骨表面损伤，骨关节炎OARSI 评分较PBS组下降72％。总体而言，本专利技术制备的靶向细胞线粒体的微纳水凝 胶微球能有效调控线粒体呼吸链的电子传递效率，有望效治疗以骨性关节炎为代 表的与线粒体呼吸链功能紊乱相关的退行性疾病。
[0014]进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向调控线粒体呼吸链的微纳水凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将SS
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31肽与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
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聚乙二醇2000
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琥珀酰亚胺酯发生酯化反应，得到功能化合物一；(2)将Wyrgrl肽的羧基经EDC/NHS活化后与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
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N
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氨基
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聚乙二醇5000发生反应，得到功能化合物二；(3)将功能化合物一和功能化合物二与蛋黄卵磷脂、胆固醇和白藜芦醇混合，经有机溶剂溶解，通过薄膜水化法制备得到纳米脂质体；(4)采用透明质酸与甲基丙烯酸酐合成甲基丙烯酸化透明质酸水凝胶，然后将步骤(3)所得纳米脂质体与水凝胶溶液混合，通过微流控装置制备水凝胶微球，然后经紫外光交联，得到所述微纳水凝胶微球。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述SS
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31肽与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
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聚乙二醇2000
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琥珀酰亚胺酯的摩尔比为2：1。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述Wyrgrl肽与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
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N

【专利技术属性】
技术研发人员：李毓灵，张静，王星宽，崔文国，蒋科，向超，严才平，
申请(专利权)人：川北医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：