一种用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提出了一种用于检测D

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测D
‑
阿洛酮糖的试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及检测
，具体而言，涉及一种用于检测D
‑
阿洛酮糖的试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成员，只存在于少数植物和某些细菌中，含量极低。随着肥胖和糖尿病等代谢综合征的发病率在世界范围内迅速增加，营养(功能性食品)和健康问题越来越受到关注。D
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阿洛酮糖因具有控血糖、保护胰岛、抗氧化等诸多功效，已逐渐成为制药、保健和食品工业的研究热点。
[0003]然而，D
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阿洛糖的应用受到其稀缺性的限制。从自然资源中提取D
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阿洛酮糖生产不现实，会消耗大量资源，增加生产成本，破坏环境。另一方面D
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阿洛酮糖的化学合成很困难，会产生有毒副产品，不适合用于食品。因此，简单、低成本、安全的阿洛酮糖生产工艺已成为阿洛酮糖商业化的主要研究方向。目前，酶法合成D
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阿洛酮糖目前已成为领域内首选的合成方法。已经筛选并鉴定的酮糖3
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差向异构酶(ketose
‑3‑
epimerase，KEase)至少有20种，包括：D
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塔格糖3
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差向异构酶(DTEase)、D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶(DAEase)和L
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核酮糖3
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差向异构酶(LREase)等。但其中大多数的酶对D
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果糖的催化活性较低且热稳定性较差，这大大的限制了生物酶法生产D
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阿洛酮糖的工业实际应用。因此，新酶的挖掘以及酶的分子改造以获得高活性高热稳定性酶分子已成为科学研究领域和工业实际应用迫切需要解决的首要问题。对新酶的挖掘以及酶分子的改造的关键是建立方法使得能够快速有效地从大型酶数据库或酶突变体库中识别出改良的酶分子。目前定量分析D
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阿洛酮糖的方法主要为色谱法，包括：薄层色谱法、气相色谱法、气相色谱
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质谱法等，其中最常用的是高效液相色谱。这些方法虽然准确，但不适合对D
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阿洛酮糖的高通量分析，而且由于测定过程需要消耗大量时间和成本过高，不允许对在酶定向进化筛选运动中所产生的大规模变异体库进行高通量筛选。因此，开发一种高效、灵敏且适合高通量筛选的试剂及检测方法来定量检测样品中D
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阿洛酮糖的浓度(含量)并筛选酮糖3
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差向异构酶是当前迫切需要的。

技术实现思路

[0004]鉴于上述问题，本专利技术提供一种用于检测D
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阿洛酮糖的试剂盒及检测方法，具有高效高通量、高灵敏度、不易受其他糖类分子干扰的特点。
[0005]本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
[0006]一方面，本申请实施例提供一种用于检测D
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阿洛酮糖的试剂盒，包括：试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ、试剂Ⅳ、以及试剂
Ⅴ
；其中，试剂Ⅰ为磷酸盐缓冲液，试剂Ⅱ的主要成分为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，试剂Ⅲ的主要成分为核糖醇脱氢酶，试剂Ⅳ的主要成分为D
‑
阿洛酮糖，试剂
Ⅴ
为NADH荧光标定检测试剂。
[0007]在本专利技术的一些实施例中，所述试剂Ⅳ为溶解于试剂Ⅰ中的D
‑
阿洛酮糖，其中D
‑
阿洛酮糖的浓度为0
‑
0.4μM；所述试剂Ⅲ为溶解于试剂Ⅰ中的核糖醇脱氢酶，其中核糖醇脱氢
酶的浓度为5～10mg/mL；所述试剂Ⅱ为溶解于试剂Ⅰ中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0
‑
0.4μM。
[0008]在本专利技术的一些实施例中，所述试剂Ⅰ由如下浓度的组分组成：KH2PO
4 0.01～0.5mg/mL，KCl 0.05～1.0mg/mL，NaCl 3.0～10.0mg/mL，Na2HPO
4 0.3～2.0mg/mL。
[0009]另一方面，本申请实施例提供一种利用上述试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
[0010]1)将试剂Ⅰ的pH调至6.5～10，将试剂Ⅱ和试剂Ⅰ混合得到混合液；
[0011]2)用试剂Ⅰ对试剂Ⅳ进行梯度或倍数稀释，得到一组具有不同D
‑
阿洛酮糖浓度的稀释溶液；以摩尔浓度计算，稀释溶液中D
‑
阿洛酮糖的浓度最高不超过混合液中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度；
[0012]3)将混合液分别与步骤2)获得的各稀释溶液等体积混合，向每个样品中加入适量试剂Ⅲ，37℃反应15min；之后反应后的样品混合液各取出50μL，加入适量试剂
Ⅴ
，37℃反应30min后检测每个样品在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值，以含有0μM阿洛酮糖样品反应后在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值为标准值；
[0013]4)根据步骤3)反应前每个样品的D
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阿洛酮糖浓度以及标准值与每个样品在反应后相对荧光值差值作D
‑
阿洛酮糖浓度与相对荧光值差值的标准曲线，同时将获得的相对荧光值差值中以最大值和最小值为端点构成的区间作为参考区间；
[0014]5)用试剂Ⅰ对待测样品进行梯度或倍数稀释，将混合液分别与稀释后的各样品等体积混合，向每个样品中加入适量试剂Ⅲ，37℃反应15min；之后反应完的样品混合液各取出50μL加入适量试剂
Ⅴ
，37℃反应30min后检测每个样品在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值，以含有0μM阿洛酮糖的样品反应后在Ex/Em＝535/587nm条件下的相对荧光值为标准值；
[0015]6)计算标准值与每个样品在反应后的相对荧光值差值，当有标准值与样品的相对荧光值差值未处于步骤4)获得的参考区间内时，则可根据相对荧光单位参照步骤4)获得的标准曲线计算得到样品对应的D
‑
阿洛酮糖浓度，最后根据步骤5)中样品对应的稀释梯度或倍数换算即可得到待测样品中D
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阿洛酮糖的浓度；如果所有标准值与样品的相对荧光差值均不在步骤4)获得的参考区间内，则需重新执行步骤5)，其中对待测样品的稀释需采用新的稀释梯度或倍数，直至有稀释后的样品相对荧光值差值单位处于步骤4)获得的参考区间内。
[0016]在本专利技术的一些实施例中，所述步骤1)获得的混合液中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0
‑
0.4μM；所述步骤2)中，试剂Ⅳ经梯度或倍数稀释得到的稀释溶液组中，D
‑
阿洛酮糖的浓度在0～0.4μM的浓度范围内分布；所述步骤3)及步骤5)中，试剂Ⅲ的添加量应满足：每毫升反应体系中核糖醇脱氢酶的含量不低于0.1mg。
[0017]本专利技术的有益本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测D
‑
阿洛酮糖的试剂盒，其特征在于，包括：试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ、试剂Ⅳ、以及试剂
Ⅴ
；其中，试剂Ⅰ为磷酸盐缓冲液，试剂Ⅱ的主要成分为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，试剂Ⅲ的主要成分为核糖醇脱氢酶，试剂Ⅳ的主要成分为D
‑
阿洛酮糖，试剂
Ⅴ
为NADH荧光标定检测试剂。2.根据权利要求1所述的用于检测D
‑
阿洛酮糖的试剂盒，其特征在于，所述试剂Ⅳ为溶解于试剂Ⅰ中的D
‑
阿洛酮糖，其中D
‑
阿洛酮糖的浓度为0
‑
0.4μM；所述试剂Ⅲ为溶解于试剂Ⅰ中的核糖醇脱氢酶，其中核糖醇脱氢酶的浓度为5～10mg/mL；所述试剂Ⅱ为溶解于试剂Ⅰ中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0
‑
0.4μM。3.根据权利要求1或2所述的用于检测D
‑
阿洛酮糖的试剂盒，其特征在于，所述试剂Ⅰ由如下浓度的组分组成：KH2PO
4 0.01～0.5mg/mL，KCl 0.05～1.0mg/mL，NaCl 3.0～10.0mg/mL，Na2HPO
4 0.3～2.0mg/mL。4.一种利用权利要求1或2所述的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将试剂Ⅰ的pH调至6.5～10，将试剂Ⅱ和试剂Ⅰ混合得到混合液；2)用试剂Ⅰ对试剂Ⅳ进行梯度或倍数稀释，得到一组具有不同D
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阿洛酮糖浓度的稀释溶液；以摩尔浓度计算，稀释溶液中D
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阿洛酮糖的浓度最高不超过混合液中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度；3)将混合液分别与步骤2)获得的各稀释溶液等体积混合，向每个样品中加入适量试剂Ⅲ，37℃反应15min；之后反应后的样品混合液各取出50μL，加入适量试剂
Ⅴ
，37℃反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦慧民，路福平，吴冕，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：