一种双位点荧光探针及其合成方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种双位点荧光探针及其合成方法和应用，所述的探针是7

【技术实现步骤摘要】
一种双位点荧光探针及其合成方法和应用


[0001]本专利技术涉及荧光探针，具体属于一种双位点荧光探针的合成，以及该探针应用于生物样品中Cys/Hcy和SO2的检测。

技术介绍

[0002]半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)在维持生物体内氧化还原稳态方面起着至关重要的作用。通常，细胞硫醇水平的变化与许多疾病有关，例如白细胞减少、牛皮癣、肝损伤、癌症和艾滋病等。其中，半胱氨酸属于合成蛋白质的20种天然氨基酸之一，是一种含巯基的非必需氨基酸，正常细胞内半胱氨酸浓度是30
‑
200μM。半胱氨酸的浓度异常会引起生长缓慢、神经性病变、肝损伤、嗜睡、水肿等疾病，与硫化氢结合的半胱氨酸在缺氧条件下可调节神经血管。同型半胱氨酸是氨基酸半胱氨酸的异种，是蛋氨酸代谢过程中的重要中间产物，血清中同型半胱氨酸的正常浓度大约是5
‑
12μM，同型半胱氨酸是人体内含硫氨基酸的重要代谢中间体，可能是动脉粥样硬化等心血管疾病的独立危险因素。同型半胱氨酸的水平异常会导致心血管疾病、精神障碍、阿尔兹海默症、妊娠并发症等。二氧化硫是一种重要的气态信号分子，以HSO3‑
/SO
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动态平衡的形式存在于活细胞中，与心血管结构和功能的调节以及抗氧化作用密切相关。研究证实，二氧化硫具有调节血管、降压、抗炎等多种功能。因此，设计一种可以识别生物样品中Cys/Hcy和SO2的荧光探针具有十分重要的意义。
[0003]目前国内外已经报道了几种仪器检测Cys/Hcy和SO2的方法，例如高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法、质谱法(MS)、电化学分析法和表面增强拉曼光谱法等，这些传统的仪器检测方法虽然可以有效的检测，但大多存在工程复杂，用时长，消费高，不能实时监测等缺点，不适合高通量的常规临床研究项目。荧光探针又称为荧光传感器，是由荧光信号和分子识别所构建的功能性有机分子。随着荧光探针的发展，荧光探针在生物学方面有着重要的应用，且用于生物或环境中一些重要的阳离子、阴离子、中性小分子的荧光探针得到了很好的发展，由于荧光探针本身具有快速响应、灵敏度高、选择性好、低毒性、实时成像等优点，使得荧光探针广泛地应用于检测。因此，开发用于生物活性硫检测的探针具有重大的意义，也具有广阔的应用前景。香豆素衍生物具有良好的溶解性、光稳定性和较大的斯托克斯位移，因此，它们通常用作荧光团。本专利技术设计了一种香豆素衍生物荧光探针，该荧光探针用于Cys/Hcy和SO2的检测，反应灵敏且具有高度选择性。该荧光探针还可用于生物样品中Cys/Hcy和SO2的检测。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的之一是提供一种双位点荧光探针及其制备方法。目的之二是提供探针的用途，即用于生物样品中Cys/Hcy和SO2检测及成像。该探针应具有灵敏度高、选择性高、检出限低和光稳定性好等优点。
[0005]本专利技术提供的一种双位点荧光探针，其是7
‑
(二乙氨基)
‑3‑
[3
‑
(5
‑
甲氧基
‑2‑
(7
‑
硝基苯并恶二唑
‑4‑
氧基)
‑
苯基)
‑3‑
氧代
‑1‑
丙烯基]香豆素，结构式为：
[0006][0007]本专利技术提供的一种双位点荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0008](1)在反应容器中按摩尔比1:1
‑
1.5加入7
‑
(二乙氨基)
‑3‑
[3
‑
(2
‑
羟基
‑5‑
甲氧基苯基)
‑3‑
氧代
‑1‑
丙烯基]香豆素和NBD
‑
Cl，加入二氯甲烷溶液溶解后，加入催化剂三乙胺，常温条件下搅拌10小时，溶液由红色变为黑色；
[0009](2)TLC跟踪反应，确定反应结束后，旋干二氯甲烷，用二氯甲烷:石油醚＝50
‑
60:1进行柱层析纯化；用无水乙醇洗涤，干燥，即得到橘红色固体产物。
[0010]进一步优选：步骤(1)中所述的7
‑
(二乙氨基)
‑3‑
[3
‑
(2
‑
羟基
‑5‑
甲氧基苯基)
‑3‑
氧代
‑1‑
丙烯基]香豆素和NBD
‑
Cl的按摩尔比1:1.5。步骤(2)中所述的二氯甲烷:石油醚＝60:1。
[0011]其合成路线如下：
[0012][0013]本专利技术提供的一种定量荧光检测Cys/Hcy和SO2的方法，其步骤为：
[0014](1)用THF配制2mM的荧光探针储备液；
[0015](2)将2.0mL PBS缓冲液/DMSO(8/2,v/v，pH 7.40)体系以及10.0μL荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上进行检测。探针本身无荧光，随着Cys/Hcy的加入，540nm处的荧光逐渐增强；随着SO
32
‑
的加入，590nm处的荧光逐渐增强；
[0016](3)以Cys/Hcy的浓度为横坐标，以540nm处的荧光强度为纵坐标绘制图，得到Cys/Hcy浓度的工作曲线，线性回归方程分别为：F＝6.8096*[Cys]+165.8280、F＝12.1531*[Hcy]+235.1302,Cys/Hcy浓度的单位为10
‑6mol/L；线性相关系数分别为R2＝0.9997、R2＝0.9945，线性响应范围为0μM
‑
150μM，检出限(LOD)分别为0.25μM、0.14μM；
[0017]以SO
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‑
浓度为横坐标，以590nm处的荧光强度为纵坐标绘制图，得到SO
32
‑
浓度的工作曲线，线性回归方程为：F＝34.1188*[SO
32
‑
]+53.8964，SO
32
‑
浓度的单位为10
‑6mol/L；线性相关系数为R2＝0.9945，线性响应范围为5μM
‑
35μM，检出限(LOD)为0.05μM。
[0018]经实验验证，常见阴离子、阳离子和氨基酸均不干扰体系对Cys/Hcy和SO2的测定。
[0019]本专利技术的荧光探针通过结合荧光共聚焦显微镜成像技术，证明了可用于检测生物样品中如细胞以及斑马鱼内的Cys/Hcy和SO2。
[0020]与现有荧光探针相比，本专利技术合成的荧光探针具有以下优点：1、本专利技术的荧光探针合成步骤简单，成本低廉且光稳定性好。2、检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现。3、探针对Cys/Hcy和SO2的响应具有选择性好、灵敏度高、检出限低等优点。4、该探针可通过双位点对Cys/Hcy和SO2进行检测和区分。5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双位点荧光探针，其特征在于，其结构式为：2.如权利要求1所述的一种双位点荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在反应容器中按摩尔比1:1
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1.5加入7
‑
(二乙氨基)
‑3‑
[3
‑
(2
‑
羟基
‑5‑
甲氧基苯基)
‑3‑
氧代
‑1‑
丙烯基]香豆素和NBD
‑
Cl，加入二氯甲烷溶液溶解后，加入催化剂三乙胺，常温条件下搅拌10小时，溶液由红色变为黑色；(2)TLC跟踪反应，确定反应结束后，旋干二氯甲烷，用二氯甲烷:石油醚＝50
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60:1进行柱层析纯化；用无水乙醇洗涤，干燥，即得到橘红色固体产物。3.如权利要求2所述的探针的制备方法，其特征在于，所述的7
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(二乙氨基)
‑3‑
[3
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(2
‑
羟基
‑5‑
甲氧基苯基)
‑3‑
氧代
‑1‑
丙烯基]香豆素和NBD
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Cl的按摩尔比1:1.5。4.如权利要求2所述的探针的制备方法，其特征在于，所述的二氯甲烷:石油醚＝60:1。5.一种定量荧光检测Cys/Hcy和SO2的方法，其特征在于，步骤为：(1)用THF配制2mM的荧光探针储备液；(2)将2....

【专利技术属性】
技术研发人员：张萌，李新峰，张永斌，钞建宾，双少敏，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：