一种同时定量检测血浆中Cys、Hcy和GSH的新型荧光探针及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种能够同时定量检测血浆中Cys、Hcy和GSH的新型荧光探针及其制备方法和用途，制备步骤包括：7

【技术实现步骤摘要】
一种同时定量检测血浆中Cys、Hcy和GSH的新型荧光探针及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及荧光检测
，尤其涉及一种用于同时定量检测区分血浆中Cys、Hcy和GSH的新型荧光探针及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)是目前人体中已知含量最丰富的小分子生物硫醇，在许多人体代谢和稳态中起着关键作用。尽管Cys、Hcy和GSH的结构和活性非常相似，但它们具有不同的生理和病理作用。其中，Cys参与酶催化、解毒、蛋白质合成和代谢。Cys异常水平可引起多种疾病，如生长迟缓、皮肤损伤、水肿、嗜睡和肝脏损害；血浆中Hcy水平升高被认为是心血管疾病、血栓形成、阿尔茨海默病、肾功能障碍和骨质疏松等高危因素。谷胱甘肽能够维持生物系统中的氧化还原稳态。谷胱甘肽水平失衡与肝损伤、艾滋病、癌症、衰老等疾病有关。血浆等生物液体是跟踪人体生物硫醇水平的最佳非侵入性基质。因此，定量检测生物液体中Cys、Hcy和GSH水平，为筛选和诊断与生物硫醇相关的疾病以及解剖其生理和病理过程提供了一种快速的方法。
[0003]目前，已有多种检测生物硫醇的分析技术被报道，与高效液相色谱(HPLC)、质谱法、毛细管电泳法和电化学等传统方法相比，荧光探针具有高选择性和高灵敏度，在生物硫醇的体外和/或体内定性和定量检测方面具有优势。到目前为止，生物硫醇荧光探针的构建已经取得了很大的进展。这些探针能够区分生物硫醇和其他氨基酸。然而，由于三种生物硫醇的结构和活性非常相似，大多数报道的荧光探针无法区分Cys、Hcy和GSH，这阻碍了对它们在生理和病理事件中的作用的进一步研究。到目前为止，已经开发出了少量特异性检测Cys、GSH和Cys/Hcy的荧光探针。此外，在不同荧光通道中能同时识别Cys和GSH以及Cys/Hcy和GSH的荧光探针报道甚少。然而，开发能够同时识别三种生物硫醇的荧光探针仍然是一个巨大的挑战。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中的上述不足之处，本专利技术提供了一种同时定量检测血浆中生物硫醇的新型荧光探针及其制备方法与应用。所述探针能够在不同pH条件下同时识别不同荧光通道中的Cys、Hcy和GSH，并且已经成功地应用于同时定量检测血浆样品中Cys、Hcy和GSH含量，它不仅选择性好，灵敏度高，而且制备方法简单。本专利技术是通过如下技术方案实现的：
[0005]一种同时定量检测血浆中Cys、Hcy和GSH的荧光探针，其结构如下：
[0006][0007]同时定量检测血浆中Cys、Hcy和GSH的荧光探针的制备方法，按照下述步骤进行：
[0008]步骤1、称取4
‑
(二乙氨基)水杨醛溶于正丁醇中，接着加入硝基乙酸乙酯和乙酸，搅拌均匀，再加入哌啶，然后将混合液加热回流搅拌反应；反应结束后，将沉淀物抽滤得到滤饼，沉淀物经正丁醇和石油醚重结晶进一步提纯，得7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
硝基；
[0009]步骤2、将氯化亚锡加到冰浴环境的浓盐酸中，随后加入步骤1制备的7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
硝基，常温搅拌，反应一段时间后，在冰浴下加入氢氧化钠使得溶液呈中性，用蒸馏水和乙酸乙酯对混合液进行萃取分液，将有机层回收，减压蒸馏除去多余的溶剂，之后用乙醇重结晶，得7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
氨基；
[0010]步骤3、将步骤2得到的7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
氨基溶于盐酸，将混合液加热回流搅拌反应；反应结束后，加入氨水中使溶液呈中性，用蒸馏水和二氯甲烷进行萃取分液，回收有机层，减压蒸馏除去多余的溶剂，得7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
羟基。
[0011]步骤4、将步骤3得到的7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
羟基和4
‑
氯
‑7‑
硝基苯并
‑2‑
氧杂
‑
1,3
‑
二唑加入到乙腈溶液中，接着加入碳酸钾，室温下搅拌反应，反应结束后，除去多余的溶剂，将残余物通过柱层析色谱法进行纯化，即可得到定量区分检测Cys、Hcy和GSH的新型荧光探针。
[0012]步骤1中，所述4
‑
(二乙氨基)水杨醛、正丁醇、硝基乙酸乙酯、哌啶、乙酸的用量比为1g～2g：10mL～20mL：0.5mL～1mL：70μL～80μL：0.2mL～0.3mL。
[0013]步骤1中，所述加热回流搅拌反应的温度为100～105℃，时间为10～12h。
[0014]步骤2中，所述氯化亚锡、浓盐酸、7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
硝基的用量比为0.6g～0.7g：2mL～4mL：0.2g～0.3g。
[0015]步骤2中，所述常温搅拌反应的时间为1～2h，所述重结晶用的温度为90℃。所述除去溶剂的方法为旋转蒸发。
[0016]步骤3中，所述7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
氨基、盐酸的用量比为0.4g～0.5g：5mL～6mL，其中盐酸的浓度为1M。
[0017]步骤3中，所述加热搅拌反应的温度为110～120℃，反应的温度时间为2～4h。所述除去溶剂的方法为旋转蒸发。
[0018]步骤4中，所述7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
羟基、4
‑
氯
‑7‑
硝基苯并
‑2‑
氧杂
‑
1,3
‑
二唑、碳酸钾、乙腈的用量比为0.3g～0.4g：0.4g～0.5g：0.2g～0.3g：4mL～5mL。
[0019]步骤4中，所述室温反应的时间为4～5h。所述除去溶剂的方法为旋转蒸发。
[0020]将本专利技术的新型荧光探针用于同时定量区分检测血浆中的Cys，Hcy和GSH的用途。
[0021]本专利技术提供的荧光探针可用于同时定量检测血浆中Cys、Hcy和GSH的含量，具体方法如下：
[0022](1)取健康志愿者静脉血3.0mL。血样置于预冷的乙二胺四乙酸(EDTA)真空管中，随后立即在4℃下2500r/min离心10min。取上清液作为人血浆进行分析。用DMSO制备了探针YF(1
×
10
‑3M)的母液。取数个5mL容量瓶，并且量取25μL荧光探针母液和1mL DMSO于每个5mL容量瓶中。然后，在每个容量瓶中分别加入血浆提取液样本上清液100μL和不同体积1
×
10
‑2M的Cys溶液(0、2.5、5、7.5、10、15、20μL)。接着将装有混合液的容量瓶分别用20mM的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4或5.6)定容到5mL，摇匀，室温放置10min。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时定量检测血浆中Cys，Hcy和GSH的新型荧光探针，其特征在于，其结构如下：2.一种同时定量检测血浆中Cys，Hcy和GSH的新型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：步骤1、制备7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
羟基，备用；步骤2、将步骤1得到的7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
羟基和4
‑
氯
‑7‑
硝基苯并
‑2‑
氧杂
‑
1,3
‑
二唑加入到乙腈溶液中，接着加入碳酸钾，室温下搅拌反应，反应结束后，除去多余的溶剂，将残余物通过柱层析色谱法进行纯化，即可得到同时定量区分检测Cys，Hcy和GSH的新型荧光探针。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
羟基、4
‑
氯
...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙凌亮，袁芳，刘卫国，陈倩，陈晓东，李璐璐，何丹，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：