一种玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物、制备方法及应用技术

本发明专利技术属于化合物技术领域，公开了一种玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物、制备方法及应用，利用玫瑰石斛生物碱粗提物得到馏分Fr.1

【技术实现步骤摘要】
一种玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于化合物
，尤其涉及一种玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]目前，玫瑰石斛为兰科石斛属植物玫瑰石斛(Dendrobium crepidatum Lindl.exPaxt.)的新鲜或干燥茎。其花观赏价值极高，花姿优雅，玲珑可爱，花色鲜艳，气味芳香，被喻为“四大观赏洋花”之一。其茎滋阴益胃，生津除烦。用于口干烦渴，阴伤津亏，病后虚热，目暗不明，食欲不振。有关玫瑰石斛的研究较少，且主要集中于抗炎和抗肺损伤方面。目前，有关玫瑰石斛提取物的相关专利多集中在其组织培养方面，关于玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物制备的相关技术方案尚未见报道。因此，亟需一种玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物及其制备方法，以填补现有技术的空白。
[0003]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中关于玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物制备的相关技术方案尚未见报道。
[0004]解决以上问题及缺陷的难度为：吲哚里西啶类生物碱是以吲哚里西啶结构为基本骨架的生物碱，多数生物碱还含有苯环结构，这也增加了其吸收光谱的强度，此类生物碱可形成二倍体结构，同时，多数吲哚里西啶类生物碱为对映异构体，含有手性中心，这也使得多种生物碱的吸光度比较小。
[0005]相比于石斛属中分离得到的其他成分的数量，石斛中的生物碱单体化合物的数量还是较少，这可能与生物碱的提取方法及其结构相关。生物碱中的共轭基团不多，在紫外下的吸收较弱，而且生物碱需要特定的显色剂碘化铋钾来显色，种种原因增加了生物碱分离的难度，前期研究者多是通过柱色谱分离的方式分离纯化生物碱，但是对于石斛属的多种石斛来说，其中的生物碱成分结构类似，极性相近，利用此种方法很难得到单一的生物碱成分。
[0006]解决以上问题及缺陷的意义为：生物碱是一类有具有多种优良活性的化合物，多有抗阿尔茨海默症、抗炎和抗肿瘤等多种功效，玫瑰石斛中分离到的生物碱多为吲哚里西啶类，以抗炎活性为主。迄今为止，石斛属中的吲哚里西啶类生物碱数量仍很少，因此，进一步甄选石斛材料进行生物碱成分的分离鉴定，以扩充石斛属的化合物库是非常有必要的，也有利于活性探索的进一步深入。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物、制备方法及应用。
[0008]本专利技术是这样实现的，一种玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物制备方法，所述玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物制备方法包括以下步骤：
[0009]步骤一，将玫瑰石斛生物碱粗提物，经常压硅胶柱色谱分离、石油醚
‑
丙酮梯度洗
脱以及TLC检测合并，共得到5个馏分Fr.1
‑
Fr.5；
[0010]步骤二，将Fr.2经硅胶柱层析分离，经30：1的石油醚
‑
丙酮等度洗脱和TLC检测合并，共得到5个馏分Fr.2.1
‑
Fr.2.5；
[0011]步骤三，将Fr.2.1经凝胶柱色谱分离得到化合物1、化合物2和化合物3；其中，所述凝胶柱色谱的二氯甲烷：甲醇＝1：1；
[0012]步骤四，将Fr.2.2经凝胶柱色谱及半制备液相等度分离纯化，得到化合物4和化合物6；
[0013]步骤五，将Fr.2.3经半制备液相等度分离纯化得到化合物8；
[0014]步骤六，将Fr.2.4经半制备液相梯度分离纯化得到化合物9、化合物10、化合物11和化合物12；
[0015]步骤七，将Fr.4经凝胶柱色谱，共得到6个馏分Fr.4.1
‑
Fr.4.6，并将Fr.4.2经凝胶柱色谱分离得到化合物5和化合物7。
[0016]进一步，步骤一中，所述石油醚
‑
丙酮梯度洗脱参数包括：50：1，30：1，20：1，15：1，10：1，5：1，2：1，丙酮。
[0017]进一步，步骤四中，所述二氯甲烷：甲醇＝4：3，所述半制备液相为65％的乙腈
‑
水，2mL/min。
[0018]进一步，步骤五中，所述半制备液相为70％的甲醇
‑
水，2mL/min，254nm。
[0019]进一步，步骤六中，所述半制备液相为60
‑
100％甲醇
‑
水，30min，2mL/min，254nm。
[0020]进一步，步骤七中，所述Fr.4经过的凝胶柱色谱的二氯甲烷：甲醇＝1：1；所述Fr.4.2经过的凝胶柱色谱的二氯甲烷：甲醇＝2：1。
[0021]本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述的玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物制备方法制备得到的玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物，所述玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物的结构如下：
[0022][0023]本专利技术的另一目的在于提供一种所述的玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物在对LPS诱导RAW 264.7细胞释放NO抑制中的应用。
[0024]进一步，所述玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物对LPS诱导RAW 264.7细胞释放NO抑制的确定方法，包括：
[0025](1)MTT法测定化合物1、2、3对RAW 264.7细胞的毒性作用
[0026]用含10％胎牛血清的培养液DMEM或者RMPI1640配成细胞悬浮液，取每孔200μL的RAW 264.7细胞悬液5
×
104个/mL接种于96孔培养板，于5％CO2，37℃恒温培养箱中培养24小时；吸出里面的培养基后加入200μL浓度为30μM的待测化合物溶液，空白对照组加入200μL DMEM完全培养液，每孔终体积200μL；37℃培养24h后，吸弃孔内培养上清液，每孔加MTT溶液200μL；置于37℃、5％CO2培养箱内继续培养4h后，除去上清液，加入等体积的DMSO溶解甲臜，震荡均匀后于570nm处测定每孔的吸光值；根据光密度OD值推测出活细胞的数目，记录结果，并计算出RAW 264.7细胞的存活率。
[0027](2)化合物1
‑
3对LPS诱导的RAW 264.7细胞产生NO的测定
[0028]通过硝酸盐还原酶法检测培养基中亚硝酸钠的量来评估RAW 264.7细胞中NO的释放，让RAW 264.7细胞在96孔细胞培养板上生长，并在5％CO2的环境中于37℃培养24h，实验组分别加入200μL浓度为30μL的化合物1、2、3，空白对照组则加入200μL的DMEM完全培养液，阳性对照组添加200μL浓度为30μM的地塞米松溶液，阴性对照组则添加200μL浓度为5μg/mL的LPS，继续培养2h，加入LPS 5μg/mL，在相同条件下继续培养24h，收集培养上清液进行检测；根据NO测定试剂盒，利用硝酸还原酶法的说明测定细胞中NO的含量。
[0029](3)数据处理
[0030]实验数据OD值采用“平均数
±
标准差”来表示，数理统计及方差分析工作采用SPSS完成。
[0031]进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物制备方法，其特征在于，所述玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物制备方法包括以下步骤：步骤一，将玫瑰石斛生物碱粗提物，经常压硅胶柱色谱分离、石油醚
‑
丙酮梯度洗脱以及TLC检测合并，共得到5个馏分Fr.1
‑
Fr.5；步骤二，将Fr.2经硅胶柱层析分离，经30：1的石油醚
‑
丙酮等度洗脱和TLC检测合并，共得到5个馏分Fr.2.1
‑
Fr.2.5；步骤三，将Fr.2.1经凝胶柱色谱分离得到化合物1、化合物2和化合物3；步骤四，将Fr.2.2经凝胶柱色谱及半制备液相等度分离纯化，得到化合物4和化合物6；步骤五，将Fr.2.3经半制备液相等度分离纯化得到化合物8；步骤六，将Fr.2.4经半制备液相梯度分离纯化得到化合物9、化合物10、化合物11和化合物12；步骤七，将Fr.4经凝胶柱色谱，共得到6个馏分Fr.4.1
‑
Fr.4.6，并将Fr.4.2经凝胶柱色谱分离得到化合物5和化合物7。2.如权利要求1所述玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物制备方法，其特征在于，步骤一中，所述石油醚
‑
丙酮梯度洗脱参数包括：50：1，30：1，20：1，15：1，10：1，5：1，2：1，丙酮。3.如权利要求1所述玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物制备方法，其特征在于，步骤三中凝胶柱色谱的二氯甲烷：甲醇＝1：1；步骤四中，所述二氯甲烷：甲醇＝4：3，所述半制备液相为65％的乙腈
‑
水，2mL/min。4.如权利要求1所述玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物制备方法，其特征在于，步骤五中，所述半制备液相为70％的甲醇
‑
水，2mL/min，254nm。5.如权利要求1所述玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物制备方法，其特征在于，步骤六中，所述半制备液相为60
‑
100％甲醇
‑
水，30min，2mL/min，254nm。6.如权利要求1所述玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物制备方法，其特征在于，步骤七中，所述Fr.4经过的凝胶柱色谱的二氯甲烷：甲醇＝1：1；所述Fr.4.2经过的凝胶柱色谱的二氯甲烷：甲醇＝2：1。7.一种由权利要求1～6任意一项所述玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物制备方法制备得到的玫瑰石斛吲哚生物碱类化合物，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：李标，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：