基于纳米粒子靶向Piezo1蛋白在急性肺损伤中的应用方法技术

本发明专利技术公开了基于纳米粒子靶向Piezo1蛋白在急性肺损伤中的应用方法，包括如下步骤：S1、备料；S2、对材料进行处理；S3、RT

【技术实现步骤摘要】
基于纳米粒子靶向Piezo1蛋白在急性肺损伤中的应用方法


[0001]本专利技术属于医疗
，具体涉及基于纳米粒子靶向Piezo1蛋白在急性肺损伤中的应用方法。

技术介绍

[0002]急性肺损伤（ALI）及急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是以弥漫性肺泡损伤为病理特征，呼吸窘迫为临床表现的呼吸危重症疾病，此类致死性疾病是ICU主要发病和死亡原因。流行病学调查显示，美国每年有近196000例ALI患者，占360万个住院日，导致75000例死亡，ARDS死亡率仍高达40%。因此深入研究其发病机制，寻找针对ALI/ARDS病理基础机制的治疗手段是目前临床的主要问题。
[0003]目前ALI发病机制尚不明确，现认为ALI的发病是一个连续动态过程，包括募集与激活炎症细胞、释放炎症因子、分泌蛋白酶、诱导凋亡、纤溶和凝血等多个层面，其中持续放大的炎症反应是ALI的根本原因。在ALI早期，局部大量中性粒细胞和巨噬细胞浸润并释放多种细胞因子如IL
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6、TNF
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α及IL
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1β，损伤肺上皮细胞和肺血管内皮细胞，造成肺泡内皮与上皮屏障的损伤。肺血管内皮
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肺泡上皮屏障受损导致肺组织通透性增加，进而导致大量富含蛋白及炎症细胞的渗出液渗出导致肺水肿程度增加。在上述病理改变下肺组织顺应性下降和氧合功能障碍，甚至出现难治性低氧血症。除了炎症细胞及细胞因子之外，NF
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κB和MARK/ERK1/2信号通路及活化状态也在ALI的发病中起重要作用。NF
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κB主要的功能是促进基因转录，包括细胞因子、生长因子、粘附分子、免疫受体和急性期蛋白。ALI中多种炎症因子转录水平依赖于NF
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κB的活化程度，这其中包括IL
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1β和TNF
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α。MAPK/ERK1/2属丝/苏氨酸蛋白激酶，正常表达于胞浆，激活后ERK发生磷酸化、二聚化，移位至细胞核，作为转录因子调节基因表达。研究证实ERK1/2活化参与了脓毒症引发的器官损伤，ERK1/2抑制剂（PD98059）可以显著减轻ALI小鼠的肺损伤程度。
[0004]当机体发生ALI时，氧合功能障碍造成机体出现呼吸窘迫症状，肺泡细胞感受异常机械扩张，位于细胞膜上的机械敏感离子通道蛋白反馈性调控细胞代谢干预ALI病情进展，机械敏感离子通道这一生物学作用有望成为干预ALI新靶点。研究人员发现应用机械敏感离子通道蛋白TRPV4的特异性抑制剂GSK2193874能有效降低LPS诱导的ALI小鼠中血清炎症因子（TNF
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α和IL
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1β）水平，保护内皮细胞功能，进而提高ALI小鼠生存率。
[0005]机械敏感性离子通道Piezo1是2010年新发现的细胞膜跨膜蛋白，一种类似三叶螺旋桨的混合物，包括一个中央孔结构域和三个外周扩展翼，扩展翼环绕中央孔构成一类质膜离子通道复合体嵌入细胞膜，机械信号通过扩展翼变形传递信号至孔核，刺激通道开放及离子流入。Piezo1可将挤压、触摸、牵拉、血液流动等物理刺激在毫秒内转化为化学信号和电信号调控细胞代谢。
[0006]研究证实Piezo1通过反馈机械刺激调控细胞炎症与凋亡反应。研究人员采用小鼠胰管泵入缓冲液的方式模拟阻塞性急性胰腺炎模型，发现胰腺细胞Piezo1显著升高，腹腔注射Piezo1抑制剂（GsMTx4）下调Piezo1表达的同时减少胰腺细胞凋亡，降低血清淀粉酶和
乳酸脱氢酶（LDH）浓度。此外，下调Piezo1能抑制髓核细胞分泌IL
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1β，下游机制与NF
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κB通路相关。在骨代谢疾病中证实Piezo1通过ERK1/2通路调控凋亡蛋白Bcl
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2影响软骨细胞凋亡，抑制其表达能缓解创伤诱导的软骨损伤。在ALI中，肺泡组织持续异常收缩和扩张，Piezo1是否参与ALI进展及潜在作用如何缺乏系统研究。
[0007]目前ALI治疗措施包括：控制原发病、呼吸支持治疗、体液管理及药物治疗等，但尚无特效治疗手段。其中雾化吸入是ALI的常用治疗手段，药物经过超声振动形成气溶胶可均匀分布于气道及肺泡区域，有利于增加局部病灶的药物浓度，缩短起效时间，减少用药剂量，并能有效减少对其他脏器凝血功能的影响，药物安全性高。雾化吸入糖皮质激素或肝素等药物治疗ALI已在临床上得到应用。近年来伴随着材料学的快速发展，医学和材料的交叉也越来越多，构建纳米材料搭载药物发挥靶向治疗作用，已在生物医疗领域得到相关应用。纳米生物医学载体（Nanoscale Carriers，NC）作为新型药物递送和缓控释系统，具有良好的生物相容性、生物可降解、粘膜吸附性和靶向性，因此它可以有效地穿过生物体内的组织间隙和生物屏障到达病变部位，对所负载的药物进行靶向输送和控制释放，从而增加了药物的生物利用度，避免了药物在传统的单独口服或注射给药过程中过早地损失或酶解，减弱了药物对组织、器官的毒副作用。因此，NC搭载体系是抗肿瘤、抗菌和活性生物大分子药物的理想载体，被认为是极具潜力的药物输送和缓释载体。研究人员发现NC包裹姜黄素、白黎醇、辛伐他丁、地塞米松等药物克服了传统药物水溶性差、稳定性低的缺点，可有效缓解ALI进展。多证据证实NC作为良好的药物递送系统已在治疗ALI中起到了良好作用。
[0008]基于上述背景，我们构建ALI模型，探讨Piezo1在ALI中的潜在作用及相关机制。同时构建基于BSA/壳聚糖纳米粒子包裹GsMTx4（NC
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GsMTx4）药载系统，通过雾化吸入方式评估NC
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GsMTx4对ALI小鼠的治疗作用。我们发现Piezo1在ALI中表达升高，并通过ERK1/2和NF
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κB通路调控ALI发生、发展。NC
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GsMTx4尺寸均匀，生物相容性良好，雾化吸入NC
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GsMTx4不但对ALI早期肺组织炎症有抑制作用，还能缓解后期的肺纤维化程度（Scheme1），有望成为治疗ALI的新药物。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供基于纳米粒子靶向Piezo1蛋白在急性肺损伤中的应用方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0010]为实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：基于纳米粒子靶向Piezo1蛋白在急性肺损伤中的应用方法，包括如下步骤：S1、备料；S2、对材料进行处理：2.1.1LPS处理A549细胞；人II型肺泡上皮系A549细胞设置为：1、PBS组、LPS（1、2.5、5、10、20）μg/mL组，处理A549细胞24h；2、PBS组、LPS（2.5μg/mL）组，分别处理12h、24h、36h，收集细胞，待用；2.1.2GsMTx4对LPS诱导的A549细胞损伤的干预作用；A549细胞设置为：1、PBS组、LPS（2.5μg/mL）组、LPS+GsMTx4（Pizol1抑制剂GsMTx42μg/mL预处理1h后与LPS2.5μg/m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于纳米粒子靶向Piezo1蛋白在急性肺损伤中的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、备料；S2、对材料进行处理：2.1.1LPS处理A549细胞；人II型肺泡上皮系A549细胞设置为：1、PBS组、LPS（1、2.5、5、10、20）μg/mL组，处理A549细胞24h；2、PBS组、LPS（2.5μg/mL）组，分别处理12h、24h、36h，收集细胞，待用；2.1.2GsMTx4对LPS诱导的A549细胞损伤的干预作用；A549细胞设置为：1、PBS组、LPS（2.5μg/mL）组、LPS+GsMTx4（Pizol1抑制剂GsMTx42μg/mL预处理1h后与LPS2.5μg/mL共培养24h）组、GsMTx4（2μg/mL）组；2、PBS组、LPS（2.5μg/mL）组、LPS（2.5μg/mL）+PD98059（10μmol/mL）组、PD98059（10μmol/mL）组，24h后收集细胞上清及细胞以备后续实验；2.2、实验动物及处理；动物伦理申明：8
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10周龄、体重20
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22g的C57/BL小鼠于实验室条件饲养：恒温20~24℃，自由饮水，标准饲料喂食，光照周期12h照明与12h黑暗交替进行；约7d待小鼠适应环境后，进行实验；动物实验严格按照实验动物管理条例进行，实验操作符合苏州大学动物伦理学要求；2.2.1LPS诱导小鼠ALI模型；C57/BL小鼠设置为：1、NS组、LPS组；采用腹腔注射脂多糖（LPS）诱导ALI模型，LPS的浓度为5mg/kg，NS组注射等体积生理盐水（NS），24h后留取肺组织和血清标本；2.2.2腹腔注射GsMTx4对LPS诱导的ALI小鼠的干预作用；C57/BL小鼠设置为：NS组、LPS组、LPS+GsMTx4组、GsMTx4组，腹腔注射LPS诱导ALI模型，NS组注射等体积NS，LPS+GsMTx4组为GsMTx4270μg/kg腹腔注射预处理1h后腹腔注射LPS，GsMTx4组为注射GsMTx4270μg/kg，24h后留取肺组织和血清标本，其中LPS的浓度为5mg/kg；2.2.3、标本采集；4%水合氯醛麻醉，摘眼球取血，室温静置90min，于1500
×
g离心15min，制备血清，取左肺滤纸吸干表面血液，用于测定肺组织湿/干比；取右上肺置于4%多聚甲醛中进行固定，待HE染色；取右肺中叶及下叶液氮瞬时冷冻后于
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80℃冰箱保存，待提取蛋白及mRNA；S3、RT
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PCR检测基因表达；C57/BL小鼠腹腔注射LPS或NS24h后，LPS的浓度为5mg/kg，取右肺组织100mg，用Trizol试剂提取各组样总RNA，再使用反转录试剂盒合成cDNA，根据试剂盒提供的方法进行实时定量PCR反应检测各组mRNA水平，GADPH作为内参；循环条件设置：预变性95℃2min，95℃5s、60℃反应40个循环，相对基因表达水平以GADPH作为内参基因，用2
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ΔΔCT
方法测定；S4、Western blotting检测蛋白表达；A549细胞或小鼠在处理24h后，RIPA试剂从细胞或小鼠肺组织提取各组样本总蛋白，BCA试剂盒定量，根据定量结果，以20μg/孔的上样量进行SDS
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PAGE电泳，分离胶浓度100mL/L，采用半干转膜法转移蛋白至硝酸纤维素膜，封闭液室温封闭，2h后加入相关一抗；４℃冰箱中孵育过夜，第2天使用TBST缓冲液清洗3次后，加入对应二抗，室温孵育2h，ECL显色液曝光显影，凝胶成像仪分析蛋白相对表达，实验结果用ImageJ图像处理软件测定蛋白条带灰
度值；S5、ELISA检测TNF
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α和IL
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1β炎症因子水平；A549细胞或小鼠在处理24h后，ELISA法检测细胞上清液或血清TNF
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α和IL
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1β炎症因子浓度，检测方法按照ELISA试剂盒进行；S6、血清LDH水平测定；小鼠在处理24h后，收集血清，全自动生化分析仪测定小鼠血清LDH水平，所有操作均按照操作说明进行；S7、HE染色小鼠肺组织及病理评分；小鼠在处理24h后，用4%多聚甲醛固定肺组织样24h，采用乙醇脱水，石蜡包埋，然后切片，切片厚度为5μm；切片进行HE染色并进行肺损伤评分；S8、免疫组化法和免疫荧光检测小鼠肺组织Piezo1表达；小鼠在处理24h后，将肺组织标本经10%中性福尔马林液固定，常规脱水、石蜡、包埋，3
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5μm厚切片，抗原修复，抗体孵育，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片，显微镜观察染色强度，行半定量分析；免疫荧光参考免疫荧光试剂盒说明书制作，切片行激光共聚焦显微镜下观察拍片；S9、检测小鼠BALF中总蛋白及细胞总数：气管插管行肺泡灌洗获取肺泡灌洗液，回收的肺泡灌洗液离心后，吸取上清液，BCA法检测总蛋白水平；去掉BALF的上清液后，其细胞团块打散后用PBS重悬，计数总细胞数；S10、肺组织湿/干质量比；检测取左肺，用滤纸吸干肺组织表面水分，称湿质量（W），置于70℃烘箱48h至恒重后测定干质量（D），计算肺组织湿/干质量比（W/D）；S11、Tunel染色检测肺组织细胞凋亡；A549细胞或小鼠在处理24h后，按照Tunel细胞凋亡试剂盒提供的方法，对切片进行染色封片，...

【专利技术属性】
技术研发人员：施勤，凌春华，刘欣欣，何家辰，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：