一种用于外泌体分离富集的微流控芯片，以及一种外泌体表面蛋白的分析方法技术

本发明专利技术提供一种用于外泌体分离富集的微流控芯片，以及一种外泌体表面蛋白的分析方法，所述微流控芯片由含有微通道的PDMS层与玻璃片层粘合而成，所述微流控芯片包括：两个进样口，一个出样口，以及一个用于外泌体捕获的微室，所述微室中包含由若干水滴状微柱组成的阵列结构。所述方法包括：外泌体的分离富集和外泌体表面蛋白的分析。本发明专利技术操作简便易推广，有望在评估癌症进展、实时检测和预后评估、个体化治疗等方面提供一个有效的技术平台。个体化治疗等方面提供一个有效的技术平台。个体化治疗等方面提供一个有效的技术平台。

【技术实现步骤摘要】
一种用于外泌体分离富集的微流控芯片，以及一种外泌体表面蛋白的分析方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，更具体地涉及一种用于外泌体分离富集的微流控芯片，以及一种外泌体表面蛋白的分析方法。

技术介绍

[0002]外泌体(Exosomes)在肿瘤细胞微环境的胞间通讯中发挥着特殊的作用。这些纳米尺度的膜囊泡粒径一般在30
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150nm之间，表面携带大量与其来源和功能密切相关的蛋白质和脂质成分，腔内部包含有DNA、microRNA、mRNA和胞质蛋白，是细胞间交流和信号转导的一种载体。肿瘤细胞分泌的外泌体进入前哨淋巴结后发出分子信号，影响肿瘤细胞的招募、细胞外基质的沉积和血管的增生，为肿瘤的侵袭转移创造了有利的环境。血液中肿瘤来源的外泌体含量随着肿瘤的生长而增加、同时随着癌症的有效治愈而下降，它们在体液特别是血液中丰度高且稳定，能够灵敏的反应出肿瘤当前的实际状态。和研究的较为深入的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)相比，肿瘤细胞分泌外泌体的行为更为活跃，在血液中的含量≥109个/毫升(远远大于CTCs的浓度1
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10个/毫升)。由于血液中微乎其微的CTCs对检测技术的要求很高，需要消耗过量珍贵的临床样本，所以外泌体被认为是很多疾病“液体活检”的新一代生物标志物，特别适合一些当前技术水平下难以分离CTCs的癌症的早期诊断。肝癌早期没有典型症状，确诊时多属中晚期，且复发率高达60％。肝癌来源外泌体相关的分析有望为评估癌症进展、实时检测和预后评估、个体化治疗等提供快速的非手术指标。除此之外，分离出的肿瘤外泌体表面蛋白可进一步用于遗传和生物分析，为我们提供一个癌症特异性信息的宝库。
[0003]由于外泌体极小的粒径和较宽的粒径分布限制了其识别和定量的准确性和灵敏度，极易产生假阴性结果，外泌体检测技术通常需要初步分离富集和识别分析两个阶段。然而要想在众多尺寸大小接近的膜衍生亚细胞结构(例如脱落小体、凋亡小体、核外颗粒体等)中分离这些变化多样的纳米尺度外泌体囊泡同样存在诸多困难。目前富集体液和细胞培养液中外泌体的方法有超速离心法、分子排阻层析、沉淀法、表面蛋白标记亲和分离方法等。超速离心法是外泌体浓缩的最为经典的方法，它包括离心速度高达200000g的差速离心步骤，需要使用常规医学实验室不具备的昂贵仪器设备，操作繁琐耗时。这种方法不仅回收率较低(5
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25％)，很难将外泌体同其他细胞外膜泡(Extracellular Vesicles，EVs)彻底分离开来，而且长时间超高速的离心会破坏外泌体的完整性，使其丧失大量蛋白和RNAs。在此基础上发展而来的蔗糖梯度离心法，利用不同浓度蔗糖溶液产生的梯度使外泌体在离心过程中沉降到相应的等密度区，从而获得较高纯度的抽提外泌体。然而这种方法的样品准备过程繁杂，在耗费大量时间的同时也提高了运行成本。基于分子排阻层析分离的商品化试剂盒，实现了外泌体的简便分离和纯化，但是它们往往需要漫长的过夜孵育步骤且价格昂贵，如用于细胞培养液中外泌体分离的ExoQuick
TM
和Total Exosome Isolation
TM
等产品。沉淀法是根据外泌体膜疏水的特性，使用疏水的化学物质(例如聚乙二醇，PEG)进行沉淀富
集，可以实现低成本、高效快速的外泌体分离。但是生物样品中常共存有大量蛋白质，PEG沉淀的外泌体中不可避免地会存在蛋白质共沉淀，因此后续的清洗步骤对于外泌体蛋白质的可靠鉴定十分重要。
[0004]当前针对分离提纯后的外泌体进行特征分析的传统手段主要有纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)、动态光散射(Dynamic light scattering，DLS)、流式细胞术(Flow cytometry)、透射电镜(Transmission electron microscope，TEM)、酶联免疫吸附试验(Enzyme
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linked immunosorbent assay，ELISA)等。NTA技术是近些年新兴的一种表征纳米颗粒的方法，它通过光学显微镜和软件追踪并分析纳米颗粒的布朗运动，从而计算出纳米颗粒的流体力学半径和浓度。它可以实时观察外泌体的活性，有利于表征蛋白聚合和分解的状态，已经成为外泌体定量技术中最为流行的技术之一。但它还是存在重现性不高的致命缺陷，由于在测试中需要手动调节仪器和软件来消除偏差，对操作者的经验和技能都提出了较高要求，浪费时间的同时也极易带来误差。TEM和DLS都是广泛应用的纳米颗粒表征形貌和粒径分布的技术手段，但由于其仪器的固有属性较难实现高通量的外泌体分析。流式细胞术可进行高通量的细胞分析，然而当它面对比细胞小100倍的外泌体时分辨率还是有所欠缺。
[0005]2012年来自麻省综合医院和哈佛医学院的Weissleder和Lee课题组在Nature medicine杂志上报道了一种可灵敏分析特异性磁粒子标记的外泌体的微型化核磁共振平台(μNMR)；随后的2014年他们在Nature biotechnology杂志上发表了基于表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术的外泌体传感研究，采用包被有不同亲和配体的纳米孔阵列来捕获特定类型的外泌体，耗样量极少且满足了大规模平行实验的需求；2016年他们又在ACS nano杂志上报道了可用来进行外泌体分析的磁力
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电化学平台，这种结合了免疫磁珠富集和酶信号放大的微型传感器可实现高度灵敏和特异性的高通量外泌体检测。除此之外，国内外其他课题组也相继报道了一些将外泌体分析和这类传统检测工具相结合的研究成果，这类研究的不断涌现，不仅丰富了外泌体定量分析的工具，还进一步引领了外泌体相关的研究工作向微型化的道路上发展趋势。
[0006]微流控芯片作为一种新颖的技术平台，近年来凭借其集成化程度高、液体流动可控等优势，已逐渐支撑起细胞分选和操控等相关研究的半壁江山。微流控芯片通道尺寸在微米量级和细胞尺寸匹配，可以灵活的将细胞培养、分选和检测等基本操作单元集成到一块几平方厘米的芯片上，非常适合进行细胞分析。根据分离的作用力或者机理不同，微流控细胞分离技术一般可分为主动式和被动式。主动分离法利用外部力场(如电场、磁场和超声等)具有分离效率高、特异性好、参数可精确控制等优点，但同时也存在制作工艺和样品标记复杂、可能改变细胞正常的形态和理化性质等问题。被动分离法利用微通道几何设计和流体水动力等方法进行筛选，需要合理的结构设计来实现高通量的分离。
[0007]近年来，越来越多的研究者尝试将微流控技术应用于外泌体的捕获和分选上，例如2010年哈佛医学院的Irimia课题组首次报道了用微流控分离外泌体的平台，他们通过微通道中功能化的anti
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CD63成功捕获到血清中的外泌体。密歇根大学的Kanwar等人设计了一种由多个窄通道相连的循环微室结构增加样品和anti
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于外泌体分离富集的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片由含有微通道的PDMS层与玻璃片层粘合而成，所述微流控芯片包括：两个进样口，一个出样口，以及一个用于外泌体捕获的微室，所述微室中包含由若干水滴状微柱组成的阵列结构。2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微柱的高度为60
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80μm，任意两相邻微柱间的距离为90
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150μm。3.一种外泌体表面蛋白的分析方法，其特征在于，包括：外泌体的分离富集：利用磁珠修饰的Ca
2+
离子依赖性的磷脂酰丝氨酸结合蛋白和外泌体表面暴露出的磷脂酰丝氨酸特异性结合原理，在微流控芯片中利用水滴状微柱阵列结构有效提高磁珠和外泌体的碰撞机会，从而实现外泌体的快速、高特异性识别，然后在金属离子螯合剂的作用下将外泌体从磁珠上洗脱下来，实现外泌体的分离富集；以及外泌体表面蛋白的分析：构建一种基于多种核酸适配体及苝四酸二酰亚胺衍生物的信号开关策略，针对分离富集的外泌体，进行外泌体表面蛋白的表达量的分析。4.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，所述外泌体的分离富集包括以下步骤：S1，提供一种根据权利要求1～2中任意一项所述的微流控芯片，并采用含有BSA的封闭液对所述微流控芯片中的通道和微柱表面进行封闭处理；S2，制备预偶联Tim4蛋白磁珠：将链霉亲和素磁珠与生物素修饰的鼠源Tim4蛋白在缓冲液中孵育制得预偶联Tim4蛋白磁珠；S3，预偶联Tim4蛋白磁珠的预吸附：以一定流速将步骤S2制备的预偶联Tim4蛋白磁珠进样到步骤S1提供的微流控芯片中，并在所述微流控芯片底部放置磁铁，使所述预偶联Tim4蛋白磁珠均匀吸附...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐慧颖，黄韦舜，靖睿，沈昕元，李越，叶邦策，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：