一种基于动物组织的低温脱脂方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种基于动物组织的低温脱脂方法及其应用，所述低温脱脂方法包括以下步骤：(1)取离体的动物组织，预处理，而后使用碱性试剂处理；(2)使用低温脂肪酶溶液处理步骤(1)得到的产物；(3)使用酸性试剂或脂肪酸分散剂溶液处理步骤(2)得到的产物，后处理，即得到脱脂后的动物组织。本发明专利技术提供的低温脱脂方法通过低温脂肪酶和酸碱试剂配合使用，大大提高了生物材料制备过程中动物组织的脱脂效率，且避免了生物材料三维结构被破坏，毒性小、安全无污染。无污染。

【技术实现步骤摘要】
一种基于动物组织的低温脱脂方法及其应用


[0001]本专利技术属于脱脂
，涉及一种基于动物组织的低温脱脂方法及其应用。

技术介绍

[0002]脂肪酶(Lipase)即三酰基甘油酰基水解酶，是一种重要的工业酶，能够催化天然油脂分解成脂肪酸、甘油和甘油单酯或甘油二酯，并能在不同反应体系条件下催化转酯、酯化、醇解等多种反应。脂肪酶广泛存在于动植物及微生物中，微生物脂肪酶比动植物脂肪酶的作用pH值更广、作用温度范围更大、底物更专一，且微生物脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，目前部分研究较多的微生物脂肪酶已获得高纯度的产品，因此微生物脂肪酶更适合进行工业化生产。
[0003]低温微生物是指在较低温度的环境下具有生长适应能力的微生物，其广泛分布于寒冷地区中，如高山、冰川、深海、南北极、冻土等。低温微生物可以在低温条件下合成具有高催化效率的低温酶类，通过这些酶将环境中的生物大分子降解为小分子，保证自身营养所需和进行正常的生命活动。产低温脂肪酶的低温微生物大部分属于气单胞菌属、假单胞菌属、青霉属、念球菌数等。
[0004]低温脂肪酶(Cold
‑
temperature lipase)是一类能在较低温度下催化油脂分解的脂肪酶，其最适温度通常比同功能的中高温脂肪酶低30℃左右，中高温脂肪酶最适温度一般为50
‑
60℃，而低温脂肪酶在0
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30℃中就可以拥有较高的酶活性。低温脂肪酶的基本性质如作用温度、最适pH值、等电点及分子量都因酶的不同而不同，例如有的低温脂肪酶最适pH值为6
‑
9，有些低温脂肪酶最适温度为30
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40℃，有些则为10
‑
15℃。
[0005]目前，在组织工程领域，以动物组织为原料的细胞外基质材料的制备是一个主要发展方向。细胞外基质是由许多大分子物质如胶原纤维、糖蛋白、弹性蛋白、生长因子等成分构成的三维结构，为各种细胞的生存及活动提供适宜的场所及微环境，调控组织器官功能。所以细胞外基质作为理想的组织修复材料，已经广泛用于临床。在细胞外基质的制备工艺中，脱脂是主要的技术难点之一，由于脂肪具有一定的免疫原性，因此需要将动物组织材料中的脂肪去除干净，以降低生物材料的免疫原性。目前的动物组织脱脂方法有许多，基本都是通过去污剂、有机溶剂、酸碱溶液等试剂进行脱脂过程。但是上述脱脂方法极不稳定，这些试剂的使用一方面导致了细胞外基质材料中的活性成分破坏，组织材料脱脂不彻底，另一方面，有害溶剂的残留会导致生物材料具有细胞毒性，从而影响生物膜材料的修复效果。而且大部分有机溶剂易挥发、有特殊气味、易燃、毒性较大，在使用中有一定安全隐患。
[0006]CN109603195A公开了一种动物组织的脱脂方法及其应用，包括如下步骤：(1)预处理：将动物组织洗净、消毒，切割成片状、块状或者捣碎成粉；(2)脱水：动物组织经乙醇溶液脱水处理；(3)萃取：将动物组织装入密闭萃取釜内进行超临界二氧化碳脱脂；(4)分离：脂肪及脂溶性杂质随着二氧化碳流体进入分离釜，脂肪及脂溶性杂质与二氧化碳分离，二氧化碳参与下一次萃取循环，脂肪及脂溶性杂质在分离釜中被去除，经过至少二次萃取循环即得。该专利技术的动物组织脱脂方法采用了超临界二氧化碳萃取处理后，动物组织的脱脂率
在99％以上，能彻底去除动物组织中的脂肪和脂溶性杂质；另一方面，经超临界二氧化碳处理后，动物组织潜在的动物病毒去除率达到99％以上。但该专利技术的脱脂温度较高，可能会破坏细胞外基质材料中的活性成分。
[0007]因此，在本领域中，期望开发一种避免生物材料三维结构被破坏、脱脂效率高、毒性小、安全无污染的脱脂方法，以提高细胞外基质制备的效率，并进一步保证细胞外基质的再生及修复活性。

技术实现思路

[0008]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于动物组织的低温脱脂方法及其应用，以解决采用传统的表面活性剂或有机溶剂脱脂方法，污染大、脱脂效率不高、破坏生物材料结构等缺陷，实现低温、无溶剂和表面活性剂的动物组织清洁、高效脱脂。本专利技术提供的低温脱脂方法通过低温脂肪酶和酸碱试剂配合使用，大大提高了生物材料制备过程中动物组织的脱脂效率，且避免了生物材料三维结构被破坏，毒性小、安全无污染。
[0009]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种基于动物组织的低温脱脂方法，所述低温脱脂方法包括以下步骤：
[0011](1)取离体的动物组织，预处理，而后使用碱性试剂处理；
[0012](2)使用低温脂肪酶溶液处理步骤(1)得到的产物；
[0013](3)使用酸性试剂或脂肪酸分散剂溶液处理步骤(2)得到的产物，后处理，即得到脱脂后的动物组织。
[0014]脱脂后的动物组织可冷冻保存或进行后续处理。
[0015]目前大多数脂肪酶是中高温酶，酶的活性温度一般都在50
‑
60℃，在低温时酶活力低，因此中高温脂肪酶较难应用于一些热稳定性较差的产品中。而低温脂肪酶在热稳定性较差的产品中具有良好的应用前景，与中高温脂肪酶相比，低温脂肪酶有利于保护产物的特性、降低生产能源消耗，pH适应性宽，对长链甘油酯具有更高的催化活性等优点，从低温环境中筛选的微生物能够分离出低温脂肪酶，可以运用于低温脱脂技术中。
[0016]在动物源性的生物支架材料制备过程中，脱脂是一个较难解决的问题，如果使用中高温脱脂方法，会破坏生物支架材料的胶原纤维和骨架结构，导致生物支架材料力学强度低，组织再生的诱导效果差。因此，利用低温脂肪酶和酸碱试剂配合使用的方法，能够在较低温度下有效脱脂，同时保护生物材料的胶原纤维结构。
[0017]本专利技术将低温脂肪酶和酸碱试剂配合使用来进行细胞外基质材料制备中的脱脂步骤，其中，低温脂肪酶能够在较低温度下进行高效脱脂，在低温条件下，既保证了动物组织材料的三维结构完整性，也提高了脱脂效率，使得脱脂更加彻底，降低生物材料的免疫原性。同时，在使用低温脂肪酶溶液处理前，使用碱性试剂进行配合使用，碱溶液浸泡后，动物组织材料的胶原纤维孔隙更加疏松，使得低温脂肪酶溶液能够更好的进入组织材料内部，作用后脱脂效果更佳，在使用低温脂肪酶溶液处理后，使用酸性试剂或脂肪酸分散剂溶液进行处理，可以将已经脱除的脂肪洗脱下来，以达到低温、高效、彻底脱脂的目的。
[0018]本专利技术技术的核心是使用低温脂肪酶催化油脂分解，一些低温脂肪酶在碱性条件下能够达到较高酶活性，碱性试剂处理后的生物材料孔隙疏松，在一定碱性环境下，加入低
温脂肪酶溶液，其可以迅速进入生物材料内部结构，水解脂肪，使脂肪酸原位形成可溶性皂，进入水相。进一步通过酸性试剂或脂肪酸分散剂进行分散，通过水即可将动物脂肪洗脱下来，从而达到低温、高效、彻底脱脂的目的。
[0019]本专利技术所述低温脱脂方法中的低温指的4～15℃。低温脱脂方法指的是此方法的各步骤均在4～15℃的较低温度下进行，在此温度下进行脱脂，不会破坏生物材料内部的三维结构和胶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于动物组织的低温脱脂方法，其特征在于，所述低温脱脂方法包括以下步骤：(1)取离体的动物组织，预处理，而后使用碱性试剂处理；(2)使用低温脂肪酶溶液处理步骤(1)得到的产物；(3)使用酸性试剂或脂肪酸分散剂溶液处理步骤(2)得到的产物，后处理，即得到脱脂后的动物组织。2.根据权利要求1所述的低温脱脂方法，其特征在于，所述动物组织包括食道、胃、肠道、尿道或膀胱中的任意一种。3.根据权利要求1或2所述的低温脱脂方法，其特征在于，所述碱性试剂包括碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述碱性试剂的浓度为0.1～5mol/L。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的低温脱脂方法，其特征在于，所述低温脂肪酶溶液中的低温脂肪酶包括Lipase ZC1脂肪酶、Lipase B5脂肪酶、JXJ
‑
7脂肪酶、JXJ
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54脂肪酶、FS119脂肪酶或LP28脂肪酶中的任意一种；优选地，所述低温脂肪酶溶液的浓度为10～500U/mL。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的低温脱脂方法，其特征在于，所述酸性试剂包括磷酸溶液、醋酸溶液或盐酸溶液中的任意一种；优选地，所述酸性试剂中溶质的质量百分含量为0.1％～5％；优选地，所述脂肪酸分散剂溶液包括三聚磷酸钠溶液、三聚磷酸钾溶液、六偏磷酸钠溶液、六偏磷酸钾溶液、磷酸钠溶液、磷酸钾溶液、焦磷酸钠溶液、焦磷酸钾溶液、硅酸钠溶液、硅酸钾溶液、偏硅酸钠溶液或偏硅酸钾溶液中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述脂肪酸分散剂溶液中溶质的质量百分含量为0.1％～5％。6.根据权利要求1
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5中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：董群，胡夏练，任恒飞，
申请(专利权)人：吾奇生物医疗科技江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：